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标题:【求助】检测磷酸化蛋白 底片无显影，原因待查.,.

jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】检测磷酸化蛋白 底片无显影，原因待查.,.


我检测的是p-akt ,分子量66kd,蛋白抽提时我已经加上了磷酸酶抑制剂，溶解样品时也加了磷酸酶抑制剂。
电泳 转膜都没问题，（转膜后用丽春红染5分钟，可以看到蛋白条带，marker也转的很好，）用蒸馏水冲洗了两次将多于的丽春红冲洗掉，继续下一步操作。。根据蛋白大小和maker的位置将目的蛋白和内参分别剪下， 封闭用5%脱脂奶粉TTBS 1小时，抗体稀释液TTBS，一抗(1：1000多抗)1小时，tbst 3*10min ,二抗(1:5000)1小时，tbst 3*10min 均在室温.一抗 二抗都是cell sognal ,新买的。ecl发光液是北京普利莱的，刚买了不到半年，，显影定影液是别人配置的，配置后室温放存一个月，，压片三分钟，（肉眼没看到荧光）结果两个蛋白都没有显影，底片一片黑色。。将底片放到显影液里不到十秒钟就便的乌黑。
各个步骤应该没问题吧，
不知道什么原因，请各位高人指点。
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mogu[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.做磷酸化的WB最好用3%BSA封闭。
2.一抗孵育的时间似乎有点短，我一般是4度过夜孵育。
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，检查一下你的显影液，胶片和暗室密封的程度，其中　必有问题，等检查完这些硬件，能压出干净片子的时候，再继续从技术层面考虑这个蛋白怎么做
凭个人的经验，片子丢到显影液里变的乌黑，
可能性最大的是显影液不匹配，第二个可能是片子曝光了，主要是这两个问题，排除以后。若还未解决，可考虑暗室问题
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jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我记得当时我同时剪下了两块底片，一块压片；另一块 在红灯地下找了以下（验证是不是在红灯下能使底片曝光）接着就放在了显影液里，接着这块底片也马上便黑了。。难道是整合底片都曝光了？？？
另外，我想把膜重新处理，在加一抗，二抗，压片曝光，可行吗，，该如何操作。。即使目的蛋白不显影，总不能内参也不显影啊 。。第一次做wb ，啥都是现学的，，还有好多事情要做，，急死人啊 。。
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jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小游abc 于 2014-4-13 01:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

呵呵，检查一下你的显影液，胶片和暗室密封的程度，其中　必有问题，等检查完这些硬件，能压出干净片子的时候，再继续从技术层面考虑这个蛋白怎么做
凭个人的经验，片子丢到显影液里变的乌黑，
可能性最大的是显影液不匹配，第二个可 ...

显影液不匹配？、难道显影液还分型号？我们用的是普利莱的ecl超敏发光液啊
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是这样的，我曾经买了一种大袋装的显影液，结果片子一丢进去，就变的乌黑，呵呵
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 jiushikeshui371 于 2014-4-13 01:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我记得当时我同时剪下了两块底片，一块压片；另一块 在红灯地下找了以下（验证是不是在红灯下能使底片曝光）接着就放在了显影液里，接着这块底片也马上便黑了。。难道是整合底片都曝光了？？？
另外，我想把膜重新处理，在加一抗，二抗，压 ...

红灯底下是不会曝光的，除非你的红灯露光，这种情况也是可能的奥。。。。
你可以直接剪底片放在显影液里，然后从别的单位能正常做WB的显影液要一点来，做个对比，哪个环节出了问题就很明确了
建议你先把这个问题搞清了，再进行你的实验
膜经过处理是可以重加一抗二抗的，这个你放心，
实验要一步来，要有耐心，把思路理清，按顺序解决问题是关键
祝实验顺利奥
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jiushikeshui371[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天我又发现了一怪事。。
我想把膜用洗脱液洗洗，重新加一抗，二抗，再显一次影试试。。。于是从院子里找了一个配方，stripping buffer0.5M NaCl，0.5M HAc，室温摇床15min。
然后用tbst洗3*5分钟。。又用丽春红染了5分钟，居然发现膜上啥都没有(转膜后我用丽春红染了一次，条带很清晰，很好的)。难道是我把膜上的蛋白戏没有了，导致显影是底片一片黑色？？
怪怪的，也不应该是stripping buffer的问题。。昨晚，我显完影后就用保鲜膜把膜包好放在也4度，应该也不会有问题啊。
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jiushikeshui371[使用道具]
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 小中大
前辈们有什么高见 啊 ，，怎么用洗脱液洗了一次 ，丽春红就染不上了，是不是把蛋白都洗去了???
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小游abc[使用道具]
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发表于 2014-4-13 01:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，没用过你这种BUFFER，所以不敢妄加评论，
想问个问题，你的膜显影过后，有没有把ECL洗去呢，如果没洗的话，就保存，可能会有不好的影响，、
到底是哪个地方处了问题，你可以尝试重新转张膜，染色（这时观察有条带），然后洗干净，STRIPPING,再染色，如果没有了，不就说明问题一定出在BUFFER上了么，你说可对，
祝实验顺利
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