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标题:【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

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发表于 2014-4-14 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形


我刚做WB，现在先只做到电泳，然后考马斯亮蓝染色。请问大家跑全蛋白的话假如做的好的话应该是什么样子呢？我用的是10%的胶，蛋白浓度1.1mg/ml，每孔上了15微升的样，跑出来的蛋白几乎全集中在60——110KD之间，也分不出条带，只是一团，其他位置就没有多少蛋白了，这是怎么回事呢？
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发表于 2014-4-14 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下图为原图，10％分离胶，左边两道是marker:分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4
后面六道是提取的全蛋白，2乘的上样缓，每孔共上15ul，蛋白浓度1.1mg/ml。
最后两道是蛋白样品不够了，放在四度冰箱里很久的BSA，居然跑出了条带！


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 小中大

蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！
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 小中大
蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！
样品是购买的碧云天的成品裂解液，主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 。50ml的培养瓶加了300微升裂解液，冰上裂解30分钟。然后-80度保存。电泳前加入上样缓冲液后100度煮5分钟。
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发表于 2014-4-14 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上样前离心了么？
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 小中大

回复 #5 glass 的帖子

上样前没有离，但是提蛋白的时候离过了12000g 10分钟
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 小中大
我是一个人做WB的，没怎么看过别人做，都是从书上和园子里看来的方法。跑的好的全蛋白应该是什么样子的呢？
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发表于 2014-4-14 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.是样品裂解后，离心12000g 10分钟取上清 ，然后冻存的么？如果是的话，应该可以，离心已经去掉细胞碎片等了。
2.你的样品上样时是否太粘了，如果太粘就不容易跑下去。适当稀释一下，再电泳看看。
3.按你的蛋白浓度，上样量不用这么大也可以，如果是1.0mm，10孔的小胶梳子 ，上10微升也不少了。
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发表于 2014-4-14 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是离心之后取上清又-20度冻存的，做的是5ml的小胶，十孔的梳子。
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发表于 2014-4-14 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样缓冲液中是否有SDS,样品是否清亮?
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