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标题:【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

PINK[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我跑的电泳图,怎么有的条带(3/4带)会弯曲呐?
电泳方向是正确的(手机拍照),第1、3、4带同为未知蛋白溶液,2带为蛋白marker.
怎么会歪歪扭扭的呐？
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主的情况我也遇到过，很相似！分析原因：问题应该不是出在胶和电泳的条件上，因为Marker跑得很好！同正如楼上几位战友所言，主要还是考虑上样量太大。但单单从楼主计算的上样量来看，上样量应该不大，平时我都加20-30ug，楼主仅加了15ug左右，所以可能还是楼主的蛋白定量有问题。可以尝试用梯度稀释来摸索加样量。（其实平时我师兄做Western都不定量，而是通过做预实验看内参表达来判断和决定加样量。）
我们实验室平时细胞提蛋白的程序是：加冰PBS洗三遍，然后加RIPA全蛋白裂解液300ul，冰上裂解10min，然后15000转4度离心15min，然后直接取上清（留10ul用Bradford比色法定量），按5：1加6*loading buffer直接煮沸5min，然后-20度保存。效果不错，楼主可以一试！
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ending[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人感觉你胶浓度不像10％的，像15％的，而且你的BSA怎么没有主带呀％我们的下层胶PH值是8.8，上层是6.8。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你要充分保证每个孔里都是一样多的样品。缓冲液要PH在8.3 这个非常有必要，在清洗玻璃板的时候最后一次一定用超纯净水去冲洗干净防止离子的干扰。基层胶电压不能超过90V，蛋白浓度过大容易形成拖尾现象，再者要保证配胶的各种试剂是好用的，过硫酸铵超过两周就不能用了，就降解了，最好少量配制，平时不用时吧所有跑电泳的有关试剂放4度。请多指教
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼上的观点。上样前离心很重要。我做蛋白电泳时离心时间短了都不行。
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youyou99[使用道具]
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发表于 2014-4-14 18:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为在上样缓冲液中或样品中另外加几微升１ＭＤＴＴ　，离心要充分．
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