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标题:【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

guagua[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上样缓冲液是配的还是买的，什么条件保存，有没有完全解冻混匀，吸取的量是否足够？最终上样是1*吗？
marker能跑好，说明胶没问题，如果不考虑蛋白制备问题的话，这个很值得考虑
上样缓冲液是在上海生工购买的，说明上让常温保存，我放在四度的，是2乘的，即和样品是一比一的关系。
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发表于 2014-4-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳缓冲液贮存液不需要调pH 的，配完了用时稀释到1乘，就是8.3。
你这个贮存液调到8.3，我觉得不对，稀释后pH会变了吧 。
电泳时，pH很重要，无论是配胶的tris还是电泳缓冲液。
电泳缓冲液配了很久了，记不太清了，当时好象就按照书上的配方配的，好象没测PH。今天临上样前测了一下，发现只有7.0。不知是不是这方面的问题。
今天打算跑胶的时候发现蛋白样品解冻后出现了沉淀（上次是清亮的），请问大家这是否说明蛋白样品有问题呢？
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发表于 2014-4-14 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

问题还是出在样品这一块，我曾经也出现过类似的情况．样品裂解后，离心12000g 10分钟取上清 ，应该可以已经去掉细胞碎片，如果切实如此，这个可以分析不是原因．电泳液我们实验室也是像ＬＺ那样存贮的，应该问题不大．
分析：１，样品中盐离子浓度过高及其他离子影响蛋白定量，因为我曾在用ＢＣＡ定量时，发现正常本应该由绿色变成紫色的竟变成兰色，导致定量不准，以至实际上样量远远超出你计算出来的，明显图中的蛋白量超过按你给出的蛋白浓度计算的量　
　　　２，脂类等杂质也会影响定量的，注意吸取上清时避免吸到粘状的物质（取组织时最好不要取有脂肪的部分）．
附我做过的考染图２幅：


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2014-4-14 17:15
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发表于 2014-4-14 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上面附件另一张图：


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2014-4-14 17:16
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发表于 2014-4-14 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉还是样品的问题吧！
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发表于 2014-4-14 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很赞同gogo额分析。本帖认为缓冲液什么的应该不是主要问题，应该是和样品本身特别是蛋白含量有关系，1mg/ml的BSA上样15ul跑page后条带也很粗，很多基因工程菌全蛋白跑电泳，目的蛋白表达的特别多也会出现某处蛋白条带很浓的现象。
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发表于 2014-4-14 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在没有看到图之前，很多的分析也只是猜测。
今天看到图后的第一感觉，也主要是样品的问题，不像是胶或缓冲液的问题。
1.上样量过大。像FHC说的，定量不准也是一方面原因，不过，不同的定量方法的干扰物质也不同，定量前应该根据样品中的成分选择合适的方法。
2.有可能样品裂解不充分。细胞内的蛋白成分很复杂的，楼主的图在35KD以下都没有什清晰的条带了，也可能是胶浓度低，所以分辨不清。不知道楼主的目的蛋白多大？
楼主先减少上样量试一下吧
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发表于 2014-4-14 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道楼主的全蛋白是什么来源,细胞分泌上清?菌体/细胞裂解?还是其他什么方法提取的蛋白?
假设样品处理没什么问题,那这样的结果只能说楼主的蛋白样品里主要就2类蛋白为主,一个是60-110kd之间那种,一个是最下面那个带.上样量都偏大很多,建议样品稀释10-50倍后再跑一次
看BSA跑的似乎还可以,买来的所谓的99%纯度的BSA,变性胶跑出来就这副德行,带很杂,可能是重组的BSA的聚合体或者变性后降解成小片段,或者本身BSA就不纯.
个人感觉,不是样品里有不溶物质的原因,如果有不溶或者说难溶物质,那跑出来的结果应该是和FHC同学的第一图一样,从加样孔到浓缩胶到分离胶都有明显的蛋白纵向拖曳痕迹,或者样品里含有盐酸胍也会跑的乱七八糟,做过全菌电泳的都应该知道.
看楼主的图,60-110kd的蛋白已经跑离这个加样孔和浓缩胶,只是上样蛋白量太大,蛋白分子量又差不多,所才形成这么大一团条带.
建议再跑一次吧,把现有的样品从1:10:50:100这样稀释做一下,再跑试试看,样品跑之前,2x loading buffer闻闻看,有没有2-ME(2-巯基乙醇)的臭味,有的话,那这个loading应该也没什么问题,100度水浴加热5-7分钟,时间和温度要充足,,然后离心一下取上清上样.应该没什么问题
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发表于 2014-4-14 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢各位前辈、战友的热心帮助！
我在这里把我做的样品以及处理方法说一下。
我提的是小鼠成纤维细胞V79的全蛋白，是未做过任何的正常细胞。我的目的蛋白是HSP70，不过现在单跑电泳就这副德性，所以还没有考虑目的蛋白的问题。
我用的是碧云天的成品裂解液，说明上的成分为：20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin ， 12000g 5分钟离心之后取上清-20度保存。并用BCA法测蛋白浓度，也是成品试剂盒。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为样品提取时离心速度不够，可以尝试增加离心速度和延长离心时间来提取上清。也可能是样品低温冻存条件引起样品沉淀，建议先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存更好。
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