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标题:【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人感觉还是样品得问题，MARKER得条带清晰，说明胶没有问题，主要还是样品浓度偏高。
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laughing妹[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人认为样品提取时离心速度不够，可以尝试增加离心速度和延长离心时间来提取上清。也可能是样品低温冻存条件引起样品沉淀，建议先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存更好。
我昨天重新提了蛋白，15000g 10分钟，-20度保存，今天取出准备加样时发现又出现了沉淀。或许先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存比较可行吧，我下次试试看。
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发表于 2014-4-14 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我感觉是样品的问题，我们实验室出过一次这样的情况，是样品提取的问题：样品比较粘稠，可能是因为取到脂肪组织，另外裂解液也不是很适用 ，后来是查文献自己配的裂解液，解决了这个问题
不知道我们的例子会不会对楼主有帮助
我的样品并不粘稠，因为提取的不是组织蛋白，所以不会有脂肪。不过也有可能是裂解液不适用 ，所以蛋白老会沉淀析出。
非常感谢以上所有前辈、战友的热心帮助
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我来说两句，
我看了你的电泳图，Mark116-35的条带在胶上只占了大约1/3的距离，你提的是全蛋白吧，大部分蛋白应该集中在这个区域，太大和太小分子量的蛋白在你所提的蛋白中只占较小的部分，从你的Marker 看分离胶似乎高于15%个人感觉。 你可以试一下12%的胶，在胶充分凝聚后再跑，在电泳时可以把最后一条Marker 跑到底，使你的蛋白充分分离。
同时我觉得电泳条件可能也有问题，你可以试试恒压浓缩胶80v，分离胶150v。
样品上样量 可能也是高了，再做一块上5，10微升试一下。
试完想着再发个图上来研究一下，我觉得主要还是电泳条件和凝胶浓度方面的问题。呵呵！祝好运！！！！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人感觉,一是样品浓度太大,二就是离心不够彻底
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发表于 2014-4-14 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

总蛋白量大约15微克，并不多，我跑过很多胶，上100的时候都有，但没有这样的问题，应该还是样品处理的问题吧。不知道你有没有在提蛋白的时候，在加入裂解液后超声呢，这样可以充分的破碎细胞。
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
战友验证图已出，大家可以就验证图发表看法，以便战友继续改进。根据图的结果我个人认为：大体方向是基本找到了（或者否定了一些方向，肯定了一些方向），但具体原因仍不清楚。
验证方法为：针对蛋白浓度过大和胶分辨率不佳，重新提取蛋白，分离较由10％改为8％，新旧一起由原来的15ul改为3、6、12ul梯度上样。
发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。
说明：1～7道marker分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kd。


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98776langtao[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

战友验证的BSA图。
我是第一次看到BSA的电泳图。
注：1～7道marker分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kd。
BSA，分子量66 210，由581个氨基酸组成．含17个双硫桥．分子长141A，半径4lA，等电点4．9．是从牛血清中分离的一种球状蛋白质，具有多个疏水结合点。


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daod[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。

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出现白色沉淀 可能是蛋白降解了啊
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laughing妹[使用道具]
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发表于 2014-4-14 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 daod 于 2014-4-14 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。

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出现白色沉淀 可能是蛋白降解了啊

是啊，找不出是什么原因。放在-20度再取出就会有沉淀，如果一直放4度就不会
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