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标题:【求助】请教关于 clean-up kit 的问题

qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教关于 clean-up kit 的问题


今天用了 clean-up kit ，问下大家，为什么最后一步有很多沉淀不溶呢 ，试剂盒也是采用得丙酮沉淀的么 ？我以前用丙酮沉淀就不溶了，后用硫酸铵就能溶，不过蛋白损失较多，今天用试剂盒处理的还没定量，大部分沉淀都没溶解，不知道怎么回事啊，沉淀没吹太干。
另外，我样品量很少，没法超声处理，有点粘，样品处理后，放－20过几天就有絮状沉淀产生，然后怎么也不溶了，若是离心除掉的话，就会损失大部分的蛋白.
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粉色萤火虫[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的裂解液成分？
我用7M Urea + 2M Thiourea，能溶。
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢,我用的7M Urea + 2M Thiourea＋2％CHAPS
会不会是我处理的蛋白太多，因为第一步产生的沉淀很多。
我的样品的动物组织，量很少，在1.5离心管研磨后，加入裂解液7M Urea + 2M Thiourea＋2％CHAPS＋PMSF 继续研磨,冰上放置1h，离心取上清，然后用试剂盒处理。你看有什么问题么？我的胶也是上半部分有条纹，所以用了试剂盒看能否改善。
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dhpbj[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

借宝地请问楼主，你的裂解液中的PMSF是什么东东啊？起什么作用？另外，你离心时用多少转多少分钟啊？谢谢你的回复
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是你的蛋白含量太高，试剂盒程序有容量限制，一般沉淀容量在１－１００ｕｇ，如果量太多，沉淀可能会不溶解，应该按比例扩大试剂用量
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xevin[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
事实，我感觉蛋白量到200ｕｇ还是可以用这个盒子的，如果完全按推荐量用，很快就用完了，还是蛮花钱的盒子。
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vcve[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的原则:不使用Clean-up Kit. Clean-Up Kit不是对于每类样品都适用.
适用不适用最关键的步骤的沉淀的重溶,有一些样品就是沉淀后溶解不了.
这个Kit没有广谱性.所以,你如需要clean-up处理,最好做个预实验.
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veiwu[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

介意不要用试剂盒处理,他的原理实际就是TCA-丙酮沉淀法.这样蛋白质容易丢失.
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PMSF 是 蛋白酶抑制剂,防止蛋白被蛋白酶水解.
另外,我感觉这个盒子用来处理动物组织样品效果还是不错的,有不溶的可能是样品处理的量太多或者本来就不溶,处理完后电泳比原来点多了,不过有竖条纹.胶的上部纵向拖尾严重,不知道什么原因,
如果提样品的时候就是用丙酮提的,就没必要再用这个盒子了,呵呵`
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红茶可乐[使用道具]
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发表于 2014-4-15 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个试剂盒处理的样品还是不错的！但要注意你处理的样品不要太多了 最多也就是200ug，你用PMSF 有剧毒，换 COCKTAIL 用用
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