【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题 - 经验共享

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标题:【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题

ero11[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1)4度保存组织肯定不行,我们一般要在-80度保存.
2)允浆过程不能离开冰,时间关系不大,我的蛋白因为要反复离心,一提就是一天,也没出过问题.离心机应预先调至4度,根据我的经验，不用留裂解时间，允浆后即离心即可
3)当然应该先把蛋白酶抑制剂先加到裂解液混匀，但是要注意有些蛋白酶抑制剂（如ＰＭＳＦ）加到水里面一段时间后就会失效，因此不能加的过早
４）尽管加入了蛋白酶抑制剂，也一定要注意温度，如果忽略了这些细节，蛋白很可能会降解掉
５）不知你测蛋白时的标准曲线怎样，和你师姐的一样吗，这可是很重要的

yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1。匀浆十分钟，时间确实有点长，建议改成10秒/次，4-6次，4度冰浴。
2。你提的是核蛋白么？那么12000g离心后，细胞核应该是在沉淀中，你去上清，得到是胞浆总蛋白。
3。建议你将组织保存在-80度或液氮。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

唉呀，万分感谢zhb_31和DIGE！！！
1、收到，我以后的需要保存的组织一定保存在-70度冰箱或液氮（注：我们这里没-80的冰箱）
2、我提的是总蛋白。
3、我决定今天把匀浆时间大大缩短。绝不超过30秒。
4、过程中的温度问题我一直都注意，不会忘的。包括离心机和匀浆器。整个过程一定是冰浴。离心机也是预调的。
5、标准曲线和师姐的一样，这个可以肯定。
6、很奇怪，我买的蛋白酶抑制剂是用异丙醇溶的，不知道对蛋白是不是会有影响？？？
再次感谢！！

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

呵呵，问题好像差不多解决了。
你的匀浆时间似乎是长了点
裂解液应该是混好抑制剂之后再用的

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

胜利！！！——今天第四次提蛋白终于取得了成功！！！第一管测得27.32，第二管测得18.43。
汇报一下今天提的情况：
先说明一下，我昨天本来打算用三种不同的程序来考验看是哪个环节导致的问题，结果今早的意外情况导致我只做了其中两组——今天我一早赶到实验室，本来说好的，师姐一早到，拿她在—70度冰箱冻的样品给我用（她昨天提的就用的这一批样品），结果师姐因其他事晚了，而且她临时要杀一只大鼠。我当时看师姐没按说好的时间来，就正在配其他液体，结果师姐突然出现了，告诉我她的一个小师妹正要取大鼠心脏内的血（而且已经麻倒了），取完后这只要死的就归我——新鲜样本呀，求之不得！！！我当然要了，也因此以下准备工作没做：
1、看到一个帖子说PMSF（苯甲基磺酰氟）（注：固体）配前可以放置常温下贮存，但配好后（注：液体）就必须放到—20度冰箱冷藏。而我今天用的是上周五配好分装后置于常温下的。（原打算今早配新鲜的）
2、离心机没有提前制冷。抽空预冷后，放样品时才发现，离心机的离心盘不知被谁拿走了……晕死。还好另找了一个离心机，但没有时间预冷了。
做了两组：
1组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆10秒/次，4次，冰上裂解5分钟，4度离心，12000转，5分钟。结果——27.32
2组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆12下（各位，确实是12下，没有写错），不在冰上裂解，直接4度离心，12000转，30分钟。结果——18.43
经验总结：其实和楼上站友分析得一模一样——我认为最主要是裂解时间以前过长了。当然，提前没有混匀RIPA和PMSF而是分别注入匀浆器这一操作也在怀疑之列，我这两天再提一次，专门针对这两个环节做几组。得了结果，再向大家汇报。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天上午又提了两组。
1组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆5分钟，冰上裂解5分钟，4度，12000转，15分钟离心。
2组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆10分钟，冰上裂解10分钟，4度，12000转，5分钟离心。
结果：1组：25.87
2组：26.11

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

总结：
1、提不出来蛋白的最大可能：裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF没有提前混好。
2、思考：匀浆时间不要过长，肉眼看不到固体组织即可；冰上裂解时间可以不要，但加上效果可能更好——5分钟即可；至于离心时间，30分钟差些，师姐那次提出41的是离了10分钟，从我做的情况来看，5分钟与15分钟似乎差别不大。初步怀疑是正态曲线分布，但考虑样本不一致的问题，不能定论，待以后有机会继续观察。
3、自己认为比较可靠的操作：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF——注入匀浆器——匀浆至看不到固体组织（约2分钟）——冰上裂解5分钟——4度，12000转，离心10分钟——取上清。
考虑到时间与金钱的问题，很抱歉不能再专门针对这一情况继续纠缠下去了，在此谢谢网上、下所有关心并给予建议的朋友们！！！

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上周末有个机会，提了四个，结果又把我搞晕了，情况汇报如下：
所有操作均为冰上匀浆约2~3分钟，无冰上裂解时间，4度，12000转，离心均为10分钟。
第一组：提前混匀RIPA和PMSF——结果18.54，纯度0.73
第二组：分别加入RIPA和PMSF，不吹打或振荡（不提前混匀）————————结果18.67，纯度0.71；
第三组：只加RIPA，且加大组织重量（减少RIPA使用浓度），不加PMSF——————结果43.31，纯度0.91；
第四组：用-20度冰箱保存的组织，将PIPA和另一种PMSF提前混匀————-——结果是—5.83
注：前三组是新鲜提取，但因实验室中午—80度冰箱室和测蛋白室都锁门了，没办法，只好把提的东西和组织一起放在—20度冰箱了。下午来时，突发奇想又做了第四组，一并测的蛋白含量。
看来是否提前匀好RIPA和PMSF，不加PMSF都不是关键。组织是否保存完善值得怀疑。RIPA的使用量似可调低些。新换的PMSF的质量也有待考查。

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-4-16 14:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对了，前些天跑了个胶，贴出来让大家看看吧。不是很清楚，算是前期工作结果的展示和汇报吧——右数第三道（前两道是别人的）是MARKER，从右数第四道开始，逐道蛋白每孔依次分别为（单位微克）10、20、40、70、180（为了解最佳浓度上样量）对了，最后一道是180加样时漏出去的，师姐看过说那一道相比较而言最漂亮，我差点气晕过去……

附件

2014-4-16 14:50

99357488.jpg (18.63 KB)

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发表于 2014-4-16 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.可能主要原因是烈解时间过长，蛋白质降解或变性。
2.离心时间和转速，有时要用高速离心机，10k，30min
3.自动分析仪有时样品少，可能有误差，不行就直接电泳，直观。

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