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标题:【求助】细胞蛋白总提不好

eve_49[使用道具]
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发表于 2014-4-17 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细胞蛋白总提不好


我提细胞蛋白时发现加入裂解液一会即变得很黏稠用抢吸都吸不动有一大团象DNA似的黏稠的东西，离心也离不下去，跑电泳发现蛋白大分子的还有但下面小分子的蛋白很模糊也很少，我的裂解液是两倍浓度的会不会是裂解强度太大了啊，准备重新配裂解液再试试。
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发表于 2014-4-17 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sonication.
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发表于 2014-4-17 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通常高速离心后会有比较黏稠的东西,不容易吹打开,但我们一般只要上清啊,上样也不上沉淀,
另外裂解液是两倍浓度的不知什么意思?最终不都用工作液吗?
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发表于 2014-4-17 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的工作液就是两倍的裂解液我把上样缓冲液和裂解液配在了一起因为之前提组织蛋白怕裂解不好就配了两倍浓度的，后来就用它提的细胞蛋白，结果提了两次都很黏稠那个黏稠的东西离心不下去就在里面悬着一吸就吸到，可能真是裂解液浓度大了，我今天把它重新稀释了一下又提了一个样明天看看效果怎么样。
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发表于 2014-4-17 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加入核酸酶
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shanzhapia696[使用道具]
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发表于 2014-4-17 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
sonication.

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严重同意！但是很多实验室没有超声仪，当初我做的时候就是小心的把这团很粘稠的东东吸出来，效果还不错，基本不影响后续实验。当认识加深后才知道这就是核酸，我用的方法其实类似于“牙签法”
如果超声破碎的话可以用30-45W，破碎10s，2次即可，中间有15s间隔，可以有效剪切DNA，但是一定要在冰上操作，以免蛋白降解。
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发表于 2014-4-17 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位帮助，我把裂解液稀释了一下发现还是那样，后来我离心前把样煮沸变性整个溶液不粘了变得很稀，拿去高速离心后发现沉淀是一个DNA沉淀样的斑点，把上清吸出来跑了电泳发现比以前的好点，我再继续想办法试试上边朋友说的超声裂解法，结果好的话再跟大家分享
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发表于 2014-4-17 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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发表于 2014-4-17 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好当然是用超声裂解了，但是有时候没有条件的话只好自己动手了。
我的经验是裂解液的量一定要够，有时候希望蛋白浓度高所以就少加裂解液但是如果离心不完全还是抽出来的蛋白混有DNA并不划算。裂解过程中时不时去振荡一下，会好些。还有建议抽蛋白的时候不要去碰那些核酸，的确影响后面的实验，我的经验是尽量少抽蛋白液也不要把核酸抽到样品中，要知道一次好的结果可以省你好多次重复的时间。
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发表于 2014-4-17 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是可以参考trizol是用细针头吹打破碎
再就是可以考虑加大一点儿裂解液和细胞压积的比例，就是同样的细胞多加裂解液
如果要求不是很高，是不是还可以使用较强的裂解液
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