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标题:【求助】Western条带有竖纹、杂点多

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western条带有竖纹、杂点多


同时做2块胶，一块做b-actin、一块做目的蛋白（23kd）。条件如下：
15V半干转膜30min，37度封闭2.5h，
actin：一抗（sc-7210）1：500，4度过夜，二抗1：10000室温2h，ECL显色；
目的蛋白：一抗1：500，4度过夜，二抗1：2000室温2h，ECL显色。
结果：
目的蛋白条带很清晰，而actin条带上有很多毛毛糙糙的竖纹，整个胶片上有很多斑点。重复了2次，都是这个结果。
分析：
应该不是封闭牛奶的原因，因目的条带很干净。我估计可能是一抗的原因，应该怎么改进，请高手多多指教！
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

actin条带是不是非常强,如果是的话应该是一抗浓度过高的原因,建议降低到1:1500试试;
如果actin条带不强又脏的话,怀疑抗体有问题.建议封闭的时间再长点,可以4度过夜.用5%的封闭液稀释抗体;同时延长过夜时间,以增加特异性结合,减少非特异性结合.
希望对你有帮助!
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
actin条带整体感觉正好，就是条带中间有好多竖纹、斑点。
抗体是新定的santa cruz国外原装的actin（H-196），SC-7210.
如果是抗体有问题的话就亏大了，
我再重新做一次，有好消息了通知大家。
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据我的实验经验有以下几种可能:
1.配的浓缩胶胶孔中有碎胶块,建议:上样前用去离子水冲洗胶孔
2.处理后的样品中有沉淀或不溶物,建议:上样前12000G离心1MIN,小心吸取上清,勿吸入沉淀
3.一抗特异性较差,建议:5%Milk封闭4度过夜,漂洗条件6个8MIN
4.二抗1:3000稀释,建议:5%Milk封闭室温1小时,漂洗条件8个8MIN
这些都是我平时的实验经验,希望对你有帮助!祝实验顺利!
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位！
向大家汇报一下结果：就是国外原装抗体出了问题！
换了抗体以后，条带就很漂亮了！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实，楼主的问题还可能是如下原因
我补充：1.跑胶时缓冲液（包括跑胶缓冲液和上样缓冲液不合适都可以造成这种结果）
2.是制备的样品不好、
3.封闭的问题（比如，封闭液中有与你一抗非特异结合的成分，也就是一抗的问题）
4.转印液和电泳液一定要用新鲜配制的
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位！
向大家汇报一下结果：就是国外原装抗体出了问题！
换了抗体以后，条带就很漂亮了！

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感谢楼主反馈信息，能否将换抗体前后两次实验结果对比图贴一下，再分析一下是否确实是抗体的问题？谢谢您的支持！
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-4-18 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个,毛毛糙糙的竖纹绝对不是抗体的问题啦!
不相信?!
你可以不做印迹,直接将电泳后的胶染色,条带也是有竖纹的.
楼上所说的样品中有不溶物,可能也会引起竖纹,
但是我有好几次遇到竖纹,后来发现是loading buffer的问题,因为不单样品有竖纹,marker的条带也有竖纹,预染MARKER嘛,电泳时可以直接看到条带的竖纹.
换了loading buffer就好了.
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