小中大【求助】哪些条件可能造成本来可溶的重组蛋白表达形成...
我有一个别人已经构建好的大肠杆菌菌株,表达单链IgG抗体。人家表达的时候目的蛋白是以可溶形式表达,我用同样的条件重复操作,结果表达蛋白始终在沉淀中,不知道是什么原因造成的。表达条件如下:
1.30C,50ml 2*YT+Amp+Chl+1%葡萄糖,过夜培养,至OD600为1.4左右
2.3000rpm 离心10min收集菌体后,用25ml 2*YT+Amp+Chl重悬菌体,加入1mM IPTG 30C诱导4小时。
3.3000rpm 离心10min收集菌体,加入2.5ml Novergen公司的Bugbuster破碎液室温破碎细胞1小时。
4. 4C,18000rpm离心40min 收集上清,用2.5ml PBS重悬沉淀,上清、沉淀同时跑SDS-PAGE和Western检测,蛋白条带在沉淀中。
由于是人家已经研究过的条件,因此我目前都只是做重复。对于试验中的操作我有几点疑问:
1.诱导前OD值过高是否有影响,我也曾经做过过夜只有0.8左右的,结果一样。
2. 我使用的培养基PH为7.0,但是过夜培养后检测PH为5.5。我用的 是Oxid的培养基,连NaCl和葡萄糖都换成Sigma的了。对方用的是Difco的培养基。
请大家帮忙分析一下