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标题:【求助】疏水层析如何确定平衡和洗脱缓冲液？

wood533[使用道具]
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发表于 2014-4-21 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】疏水层析如何确定平衡和洗脱缓冲液？


我现在用的是AKTA purifier ，跑的是Phenyl-Sepharose，我将第一步离子交换得到的目的蛋白峰溶液的盐浓度增加至4mol/L NaCl （例如：第一步我是用0.3mol/L NaCl 的10mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH7.4)洗脱出目的蛋白峰，我取10ml此蛋白峰溶液加入2.16 g（4－0.3）×0.01×58.44=2.16） NaCl使其盐浓度增加至4mol/L NaCl ），文献上只说是用2mol/L NaCl 的10mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH7.4)洗脱，那么我用什么来平衡柱子和洗脱不结合蛋白呢？
我原来的设置是：A溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液 B溶液：2 mol/L NaCl的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
流速 1.00 ml/min 上样 2ml （样品为第一步的目的蛋白峰，使其盐浓度增加至4 mol/L NaCl ）
用A平衡5.00倍柱体积 ，上样后用A 洗脱不结合蛋白，洗到基线水平后，用 B溶液 洗脱目的蛋白
我感觉我用错缓冲液了， 我的A液是不是应该是4mol/L NaCl的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液吧？？ 用它来平衡柱子、上样、洗到基线水平，最后洗脱目的蛋白时用2mol/L NaCl的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液啊！
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发表于 2014-4-21 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请各位高手帮看看，我不敢确定是不是那么做，我就可以在用2天蛋白纯化仪，下次再用就要7月中旬了，时间宝贵啊！！ 请大家帮帮忙，万分感激！
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发表于 2014-4-21 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

疏水层析是高盐上样，低盐洗脱，这么看来你的A应该是4mol/L NaCl的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
其实你有最好的层析设备AKTA purifier ，你完全可以这么操作（看样子你使用的应该是1ml kit预装柱）：
A溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
B溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
然后在AKTA purifier编辑方法，流速流速 1.00 ml/min 上样 2ml ，用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，在20CV（也即是20个柱体积）内线性梯度洗脱，浓度是从0%B变化到100%，然后收集每一管，包括流穿，测定你的目的蛋白在哪一管中，然后从AKTA purifier 的曲线图上，看看你目的蛋白洗脱时的B的浓度（例如50%，也就是2mol/L NaCl ，如果是70%B那就是1.2mol/L NaCl ），就可以确定大概在那个浓度下你的目的蛋白可以被洗脱
然后编辑方法，用A上样，同样流速同样上样体积，进行梯度洗脱，这个梯度就是你前面摸索到的浓度，如果试验结果你还感觉不满意，那么这个浓度左右进行微调就可以了。
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发表于 2014-4-21 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

太好了，我还一直不太敢确定我的A液呢，做了好多次了，直到前天我才觉得我的A液用的不对，你这么一说我就放心了。
我是自己装的柱子25ml，昨天白天我跑了一次线性但是很奇怪，竟然没有峰；晚上又跑了个梯度也是没有峰，很是奇怪。
A溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
B溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
线性方法编辑：流速流速 1.50 ml/min ，Start-ConcB（%B）我设的是100，那么就是说先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的100%B洗脱未结合的蛋白，在15CV内线性梯度洗脱，浓度是从100%B变化到0%，结果什么也没有。（图在附件里）
阶段梯度编辑方法：流速流速 1.00 ml/min ，A、B溶液同上，Start-ConcB（%B）仍为100先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，设置了5个阶段梯度洗脱（盐浓度是从4到0mol/LNaCl），每个阶段洗脱用4CV，结果仍是什么也没有。
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发表于 2014-4-21 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图中的那个峰有你的目的蛋白吗？
有几种可能性:
1.目的蛋白没有被洗脱下来，就是你的蛋白和介质的结合力太强了，你可以尝试用水或者pH9.0的缓冲液洗脱一下，看看是否有蛋白被洗脱。如果有目的蛋白被洗脱，你可以降低你上样的盐浓度
2。确定一下你图中那个尖峰什么？有你的目的蛋白吗？

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太好了，我还一直不太敢确定我的A液呢，做了好多次了，直到前天我才觉得我的A液用的不对，你这么一说我就放心了。
我是自己装的柱子25ml，昨天白天我跑了一次线性但是很奇怪，竟然没有峰；晚上又跑了个梯度也是没有峰，很是奇怪。
A溶液：pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
B溶液：4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液
线性方法编辑：流速流速 1.50 ml/min ，Start-ConcB（%B）我设的是100，那么就是说先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的100%B洗脱未结合的蛋白，在15CV内线性梯度洗脱，浓度是从100%B变化到0%，结果什么也没有。（图在附件里）
阶段梯度编辑方法：流速流速 1.00 ml/min ，A、B溶液同上，Start-ConcB（%B）仍为100先用100%B液3CV平衡，上样 2ml， 用然后2CV的A洗脱未结合的蛋白，设置了5个阶段梯度洗脱（盐浓度是从4到0mol/LNaCl），每个阶段洗脱用4CV，结果仍是什么也没有。
......


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发表于 2014-4-21 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那个尖峰（上样时洗脱不结合蛋白的峰），还没有进行正式的洗脱呢。
你的建议我明白了，1是结合太牢了洗不下来了，2是没有结合上去，是这样理解吧！
我也跑了一次直接就用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱的，
先用4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液平衡3CV后，上样，再用4mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗3CV到基线水平，最后用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV，结果出峰。图在附件里
我现在很是疑惑，为什么线性和阶段梯度都不出来，而直接用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱却出了呢？？
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 小中大

图中可见换2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV时候电导突然降特别低,所以出峰了,怀疑换缓冲液时没用2mol/L NaCl pH 7.4 0.01 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱5CV把管道中的水洗干净,所以导致洗出来了.此外需要对各峰进行电泳检测,否则很难知道是什么东西,同时这样也更好摸索条件,否则只看峰是没用的,有的时候活性最高的地方检测器显示不一定是峰,所以活性检测也很重要.没检测手段配合很难做好纯化.
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发表于 2014-4-21 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我把我的蛋白纯化图都看了一遍，确实每一个出峰的地方都是电导下降的特快，要不我阶段梯度和线性都洗脱不出来峰呢。那这样的问题怎么解决呢，每次清洗完管道后留在管道里的都是纯净水啊？
是不是可以在没有挂柱子的时候先分别拿缓冲液洗管道，这样的话管道内就会充满溶液了。
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-4-21 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对,换什么溶液用什么溶液清洗管道和泵,机器本身就可以设定,连着柱子也没关系,清洗泵和管道的时候是不会过柱子的,所以不需要不接柱子,否则挂上的蛋白在你换溶液就被冲下来了.你问问管机器或者用这机器比较熟悉的人,这样会更好点.
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发表于 2014-4-21 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

通过你的纯化图谱可以看出：你在梯度洗脱的时候，肯定没有将A、B泵事先平衡好，才出现了电导突然降到很低。一般这种阶梯洗脱的时候，需要先用你所想要的盐浓度，设定好B泵(高盐)的百分比，然后走旁路(即不经过层析柱)，然后让缓冲液的电导平衡到相对应的盐浓度后，才切换管道进柱，这样就不会出现在洗脱过程当中，出现电导变化如此大的情况。你的那个蛋白洗脱峰有可能就是因为电导的急剧下降导致的。
另外在看一下你加入那么高的盐，上柱前目的蛋白确定还存在吗？有没有可能导致部分沉淀，蛋白量减少，因此你在线性洗脱的时候，蛋白没办法富集，全程都有(蛋白状态不是很均一的时候)，但量都特少，导致洗脱峰不明显或电泳没有目的蛋白。
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