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标题:【求助】有做酵母双杂交的战友吗？

koook5695[使用道具]
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发表于 2014-5-10 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有做酵母双杂交的战友吗？


我以前是学工业微生物的，现在老板忽然让我做酵母双杂交，很多东西都是第一次接触到，就是感觉手生。倒是看了不少资料，实验室使用的是Y2H system3，文库是构建好的Y187酵母菌文库，打算作mating，有没有这方面的高手呢？大家相互交流讨论一下～
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-5-10 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

自己给自己顶一个，现在已经遇到一点问题了，老板叫我验证下文库质量，首先测了滴度，还不错的说，然后我想随机挑几个菌落用载体插入片段的扩增引物直接来PCR，今天做了，结果电泳什么也没有看到。 随后考虑的是只有直接提酵母菌质粒来PCR跑跑看，现在手头没有提酵母菌质粒的方法，哪位大侠不吝赐教啊？还有就是如果有更好的检验文库质量的方法就更好了～多谢多谢先～
另外还有个问题，买来的文库构建在Y187酵母菌中，共5ml，还需要扩增吗？扩增的方法是不是和扩增DH5a有所不同那？
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-5-10 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你给rainfly发了PM是吧，那是我师兄，我不小心用了他的ID，hehe
你的问题，我不明白你说的“用载体插入片段的扩增引物直接来PCR”，
是这样，不用做PCR的，你的引物应该不会对文库质粒有效。之所以要扩增文库，无非是确保收集尽可能多的克隆，然后摇菌至很浓，然后大提质粒。
酵母提质粒的方法很多网站有介绍了，clontech公司上面的酵母双杂系统2和系统3的手册上都有，也有公司卖这种试剂盒的
我也新手～～～共同进步，呵呵
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-5-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
之所以想扩增文库单克隆片段，是老板让我验证文库丰度做的，过程之麻烦啊。我现在已经着手，等做出来我们交流哈。
然后想问问关于扩增，很多文献上扩增文库都是构建在大肠杆菌的文库扩增方法哈，但是我这个文库是酵母菌文库，扩增大量摇菌时，能否保证所有菌都能均一生长呢？也就是说会不会有的插入片段可能会给菌体带来微弱毒性，导致在生长过程中受到竞争性抑制？为了这个原因，我一直不敢进行扩增，毕竟一支文库那么贵的啊～：）
希望以后多多交流哈～
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阿敏[使用道具]
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发表于 2014-5-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自己给自己顶一个，现在已经遇到一点问题了，老板叫我验证下文库质量，首先测了滴度，还不错的说，然后我想随机挑几个菌落用载体插入片段的扩增引物直接来PCR，今天做了，结果电泳什么也没有看到。 随后考虑的是只有直接提酵母菌质粒来PCR跑跑看，现在手头没有提酵母菌质粒的方法，哪位大侠不吝赐教啊？还有就是如果有更好的检验文库质量的方法就更好了～多谢多谢先～
另外还有个问题，买来的文库构建在Y187酵母菌中，共5ml，还需要扩增吗？扩增的方法是不是和扩增DH5a有所不同那？

==============================================================================================================

你扩增引物质直接PCR做不出来的原因最关键的最于,菌落PCR对于酵母假阴性太高.我曾经做过一个对照:A.直接挑取酵母为模板做菌落PCR,成功率13%,而且目的条带很浅很浅;B.酸洗玻璃株法提取质粒为template来做PCR,成功率100%;C.反复冻融后直接菌落PCR,和A差别不大.
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-5-10 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 阿敏 于 2014-5-10 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
自己给自己顶一个，现在已经遇到一点问题了，老板叫我验证下文库质量，首先测了滴度，还不错的说，然后我想随机挑几个菌落用载体插入片段的扩增引物直接来PCR，今天做了，结果电泳什么也没有看到。 随后考虑的是只有直接提酵母菌质 ...

我也发现酵母菌破壁比较困难，直接菌落PCR几乎是不可能的，后来用蜗牛酶破壁提取DNA，再转化大肠杆菌，麻烦点，但是有结果。接下来的问题就是文库扩增和筛库了，以后还需要大家的帮助，请多多指教哈。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-5-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你是用什么方法提取酵母质粒的,如何除去酵母本身的基因,我现在提取的酵母质粒方法,无法分开酵母本身的基因和prey质粒,我将这种混合质粒转到大肠杆菌中,用抗性平板筛选,仍然分不开,用空酵母质粒做对照,能转进去,也生长,也能提出质粒,做PCR也能批出来,用限制性E切,条带比较乱,无法判断.
希望做过的各位高手指点迷津,我如何才能把prey质粒从酵母中"单提出来"
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xiaohuili1323[使用道具]
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发表于 2015-5-14 14:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 koook5695 的帖子

您好，我刚刚开始做酵母双杂，遇到些问题想请教您。。我是用一个bait筛选一个Library，AH109和Y187mating之后涂板。。我本来打算先在二缺+底物筛，再到四缺+底物筛。但是现在涂了二缺的大板子，就很浓，背景一片灰，有的一片蓝，没法挑单克隆啊。。是这个筛选策略有问题还是涂得问题啊？要稀释多少倍涂吗？这可在呢么办啊？望能和您进一步交流，请您赐教。我的qq 799980896,谢谢！
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