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标题:[未解决]【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？

  [未解决]本主题悬赏 可用分 10  
am10[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？


请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？做了几次预实验结果都不理想，跑的是细胞裂解液，不知道跑分子量大的蛋白是和小分子量蛋白有什么区别？包括转膜液、转移时间等等，希望大家指教。
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plaa[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过几次大分子的蛋白，我们采用的是8%的胶，湿转法，低电压4度过夜 或冰浴70V恒压转8-10小时，做出的结果还是比较特异的
希望这些对你有帮助
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发表于 2014-5-12 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大分子蛋白跑胶时难度大点，最好用低浓度的胶，我们用的是6%的胶，取胶时容易破哦！转膜时一般低电压长时间冰箱内转效果会好些，我们用60mA,转膜过夜。转移液倒是没有什么特别要求！祝实验顺利！
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发表于 2014-5-12 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的也是6%的胶，冰浴，200MA，210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的也是6%的胶，冰浴，200MA，210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。
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am10[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像大家的转膜条件比我的强烈一点，我一般用的是100v转1个小时，或者20mA过夜转，彩虹Marker一般转的还可以，是不是弱了一点啊，难道问题就在这里？
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发表于 2014-5-12 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做560kd,建议40ma，过夜（12-18小时）
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也做过２００ＫＤ的大分子，条件还是比较成熟，希望对你有用．
跑胶：分离胶用６％，如果要同时做内参切两快胶可以用　８％，只要根据marker把目的蛋白切进去就可以．
转膜：大分子建议湿转效果比较好，条件可能根据仪器不同而有所不同，我用过ＢＩＯ－ＲＡＤ的湿转仪，恒压１００Ｖ转２．５小时．
　　　半干转也可以，条件也相对比较容易控制，恒流１．５－２mA/cm2,转２．５小时．对于大分子蛋白转膜液中最好加入ＳＤＳ．
希望实验成功．
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发表于 2014-5-12 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上战友,大分子蛋白转膜液中最好加入ＳＤＳ,那么加多少浓度较合适?你是不是加了之后效果比较好呢
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hustwb[使用道具]
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发表于 2014-5-12 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的胶浓度7.5%，半干转，恒流2.5mA/cm2,转２.5h．
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