小中大我要纯化的融合蛋白加GST一共100多KD。做了一个多月了还是纯化不出来。给我质粒的那位学者说这种蛋白很容易被水解,诱导表达后跑SDS-PAGE看不出增强带,建议我直接纯化然后再跑电泳。可是我纯化后跑电泳还是看不到任何带。我个人认为要是蛋白降解导致没有带的话,至少应该能在电泳后看到GST或者其他降解片段,可是我却没看到任何条带。我在诱导时已经加了1mM的PMSF,而且在裂解液里把实验室有的蛋白酶抑制剂都加了, 还是没什么用。这位学者很友好,把他们的实验方法也给我了,其中就是一种抑制剂不一样,他们用的是AEBSF我用的是PMSF。我是束手无策了,各位有什么高见救救我吧。 非常感谢!
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我们实验室经常纯化真核蛋白,包括人类的、拟南芥的。
通常我认为GST融合表达,在促进折叠方面方面比起MBP融合要差的多,但是表达情况还是很好的,一般表达量还是特别的大,但是经常在包含体中。如果你的蛋白比较重要的话,我倒是建议你用Pmal系列的。在促进折叠方面,效果好一些,至于表达情况就要看你蛋白自身的性质了。
用Rosetta(DE3)就可以了。