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标题:【求助】GST融合蛋白纯化不出来

caihong[使用道具]
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建议先不要做纯化部分的实验
在表达阶段,多做几个梯度实验,比较一下不同温度、诱导剂浓度和诱导时间对表达的影响,并且同事分析不溶蛋白与可溶蛋白的情况,需要做一个wb检测,才能确定你的蛋白究竟是否表达。gst融合蛋白一般可溶性是比较好的,分子量从30-100kDa的,都有希望做出可溶的,所以表达需要优化一下。
蛋白抽提部分,也需要做的细致一些,GST融合蛋白是不稳定,而且表达过程容易产生终止,后续处理时会发生标签脱落等问题,破菌一步很关键,当然不是抑制剂加的越多越好,其实只要加一种inhibitor cocktail就可以了,抑制剂太多会影响纯化,也有可能使蛋白质失活
我觉得你把前面的实验先做好,再考虑纯化,不要一股脑全做下来,否则很难分析。
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vivian4123[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 caihong 于 2014-5-15 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议先不要做纯化部分的实验
在表达阶段,多做几个梯度实验,比较一下不同温度、诱导剂浓度和诱导时间对表达的影响,并且同事分析不溶蛋白与可溶蛋白的情况,需要做一个wb检测,才能确定你的蛋白究竟是否表达。gst融合蛋白一 ...


楼上 说的标签脱落是什么意思呢 难道表达出来的蛋白中的GST会掉下来?
不过我倒是发现又时候蛋白倒是真的很容易降解 而降解的位置刚好在GST处?我们用过凝血酶酶切下的GST做过电泳,位置是一样的
此外不确定你说的inhibitor cocktail是用什么? 我们偶尔会用叠氮钠一类的抑菌的东西
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caihong[使用道具]
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回复 #12 vivian4123 的帖子

GST确实会从蛋白上掉下来,具体原因也很难说,并不都是蛋白酶或者降解产生的。
inhibitor cocktail是一种商品化的蛋白酶抑制剂,里面有多种成分,可以抑制多种蛋白酶,做成片剂的形式,使用的时候按照一定比例溶解就可以了。和叠氮钠是两回事。
roche的还不错。
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小糖块[使用道具]
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我要纯化的融合蛋白加GST一共100多KD。做了一个多月了还是纯化不出来。给我质粒的那位学者说这种蛋白很容易被水解,诱导表达后跑SDS-PAGE看不出增强带,建议我直接纯化然后再跑电泳。可是我纯化后跑电泳还是看不到任何带。我个人认为要是蛋白降解导致没有带的话,至少应该能在电泳后看到GST或者其他降解片段,可是我却没看到任何条带。我在诱导时已经加了1mM的PMSF,而且在裂解液里把实验室有的蛋白酶抑制剂都加了, 还是没什么用。这位学者很友好,把他们的实验方法也给我了,其中就是一种抑制剂不一样,他们用的是AEBSF我用的是PMSF。我是束手无策了,各位有什么高见救救我吧。 非常感谢!

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我们实验室经常纯化真核蛋白,包括人类的、拟南芥的。
通常我认为GST融合表达,在促进折叠方面方面比起MBP融合要差的多,但是表达情况还是很好的,一般表达量还是特别的大,但是经常在包含体中。如果你的蛋白比较重要的话,我倒是建议你用Pmal系列的。在促进折叠方面,效果好一些,至于表达情况就要看你蛋白自身的性质了。
用Rosetta(DE3)就可以了。
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vivian4123[使用道具]
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纯化GST蛋白真的需要运气的
有的很容易做,一步就可以很纯
走运一点的可以再加一步肝素亲和或者别的什么
很多的结果都会出现杂带和GST附近的降解蛋白,就非常难办了。
即使用昆虫表达系统,也不能完全排除这些问题。
如果你的蛋白纯度要求较高,并且最终不能有gst标签的话,建议不要使用这个系统,最终切除标签也很麻烦,需要引入凝血酶还有分离凝血酶和目标蛋白的其他因子
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rxcc33[使用道具]
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谢谢各位高见,我会试着在表达上下功夫。可能更本没表达。
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rxcc33[使用道具]
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我查了蛋白的CDS区,发现721个密码子中有55个稀有密码子。用Rosetta(de3)就可以补充了吗?有人说用Rosetta2啊。请问我到底该用哪种Rosetta?谢谢!
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小糖块[使用道具]
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你可以试试Rosetta(de3),我们实验室表达人的一般都用它,效果是大大的好啊
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rxcc33[使用道具]
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请问小糖块:Rosetta(de3)在哪里卖?
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rxcc33[使用道具]
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你们实验室现在还有吗?能不能提供一点点救急啊?我的实验卡到这里没法进行下去了。
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