【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达？

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标题:【求助】目的基因在大肠和酵母中都不表达？

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

基因为1800多bp，最初是克隆到表达载体pPIC9K中，转化毕赤酵母GS115，提转化子的基因组DNA，经测序基因和读码框都正确，诱导发酵后跑SDS－PAGE，改变诱导条件后重复多次还是没有表达目的蛋白。
后又尝试原核表达，载体是pET30a，宿主菌BL21，酶切位点是Sal I和Not I，上游酶切位点Sal I后加了两个碱基以保证读码框完整，经测序基因和读码框也都是正确的，转化到BL21后用菌落PCR验证，劈出的条带大小也符合。然后就是摇瓶发酵，当OD600＝0.6左右时加IPTG至1mM，4小时后取样，超声破碎，分别取上清和沉淀跑SDS－PAGE，就是没有表达目的蛋白。
现在什么能试的方法都试过了，诱导物浓度、诱导时间、诱导温度、破碎缓冲液，甚至摇床转速都试过了，真是拿它没折了，请做过表达的有经验的大虾们分析一下，看看究竟可能是哪里有问题，万分感谢！！！
后来又克隆了另一个基因2400多bp，还是用pET30a，也没有表达。

bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是膜蛋白吗？

remenb[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白的具体名称和特性说说。

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 remenb 于 2014-5-27 15:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

蛋白的具体名称和特性说说。

对细胞应该没有毒性

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是蛋白电泳图，各位战友看看
目的蛋白大小应该在第一和第二条marker之间（从上往下），marker左侧一条是对照，再往左六条都是样品，好象和对照没什么区别。marker右侧两条是不加IPTG的样品，它在第一条marker位置(97kDa)比加诱导物的少一条带，如果这条带是载体上的，好象又太大了

附件

2014-5-27 15:51

83891468.snap.jpg (18.42 KB)

ero11[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你表达的蛋白分子量比较大，至少应该有7万吧，所以表达的产物，久别指望有很多，酵母表达系统并不适合表达较大分子的蛋白。在大肠杆菌中表达量与宿主，质粒的稳定性，稀有密码子的多少，所表达蛋白性质等多种因素有关，建议你再换几种质粒和菌种试试。

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ero11 于 2014-5-27 15:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先，你表达的蛋白分子量比较大，至少应该有7万吧，所以表达的产物，久别指望有很多，酵母表达系统并不适合表达较大分子的蛋白。在大肠杆菌中表达量与宿主，质粒的稳定性，稀有密码子的多少，所表达蛋白性质等多种因素有关，建议你再 ...

对，分子量大概7万。我查了一下基因里使用率在5％以下的密码子有26个，不知道算不算多。想把宿主菌换成rosetta试试看，谁有的能交换共享一下吗?

wood533[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先做WESTERN 分析一下有不有你的目标蛋白质
>70KD 的蛋白质在大肠杆菌中有时很难表达的或者表达量很低的

INK[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

按照你的做法，你在你的目的蛋白N端融合上了太多的氨基酸了（好象大约有５０个左右），你的蛋白本来就大，现在更大了，如果你的序列中没有NdeI位点，你能不能尝试使用NdeI这个位点来表达看看呢？

lagua123[使用道具]
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发表于 2014-5-27 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 INK 于 2014-5-27 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

按照你的做法，你在你的目的蛋白N端融合上了太多的氨基酸了（好象大约有５０个左右），你的蛋白本来就大，现在更大了，如果你的序列中没有NdeI位点，你能不能尝试使用NdeI这个位点来表达看看呢？ ...

可以用，但是如果用NdeI位点，没有His Tag，纯化就比较麻烦了

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