蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 18  2/2 ‹‹12
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？

remenb[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
11

发表于 2014-5-28 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有问题，既然抗体是特异性结合，为什么不能把两个一抗混在一起孵育？二抗就可以用同一个。这样可行吗？请高手赐教！
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
12

发表于 2014-5-28 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也是听说需要洗脱,可是有人使用发光过的再TBST洗一下,然后再加一抗孵育就可以了,效果也可以.
顶部
plaa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77350
精华 0
积分 464
帖子 588
信誉分 100
可用分 3778
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
13

发表于 2014-5-28 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜显色后接下来有这么几种做法：
（1）  可用TBST漂洗后直接加ＥＣＬ压片；
（2）  TBST飘洗后重加二抗孵育，再加ＥＣＬ压片；
（3）  洗脱一抗二抗后重新牛奶封闭继续后续检测。
一般可用（1）、(3)两种方法都可，我做过的，质量还可以，但效果可能逐渐减低，四次之后已经压不出带了。
顶部
purrr[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
14

发表于 2014-5-28 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看有人洗膜时是用TBST,有人用PBS+TW20，甚有人直接用PBS，有区别吗？效果好的应是怎样？？？
顶部
cj_mondy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76095
精华 0
积分 627
帖子 853
信誉分 100
可用分 5201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
15

发表于 2014-5-28 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。

===============================================================================

你可以根据你的pvdf膜的型号在线搜索一下吧，
Stripping and Reprobing for Western Blot
Buffers:
 Erasure Buffer: 2% (w/v) SDS , 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 20°C), 100 mM b-mercaptoethanol.
 TS Buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 20°C), 150 mM NaCl.
 Blocking Solution: 5% (w/v) nonfat dry milk in PBST Buffer
Protocol:
After performing chemiluminescent western blot development and film exposure:
1. Strip antibodies by incubating blot for 30-90 minutes at 50°C in Erasure Buffer.
2. Wash 2 times, 10 minutes each wash, in PBST Buffer.
3. Block for 2.5 hours in Blocking Solution.
4. Incubate with new primary and secondary antibodies.
5. Wash three times with appropriate wash solution after each antibody incubation.
6. React 1 minute with LumiGLOÒ Chemiluminescent Substrate.
7. Expose to X-ray film for desired amount of time and develop.
我说的送阳性对照是ABCAM公司近期的活动，其它公司的我就不知了：）
顶部
purrr[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
16

发表于 2014-5-28 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！
买的.北京的欣源嘉和就有卖的 "
请问，
北京的欣源嘉和是什么公司，有网址吗？我怎么找不到？
顶部
purrr[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72864
精华 0
积分 362
帖子 384
信誉分 100
可用分 2786
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
17

发表于 2014-5-28 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
买的.北京的欣源嘉和就有卖的

=========================================================================================

不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！
买的.北京的欣源嘉和就有卖的 "
请问，
北京的欣源嘉和是什么公司，有网址吗？我怎么找不到？
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
18

发表于 2014-5-28 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Stripping buffer主要是有以下几种方法组成，其强度不断增加:
1.TBST-T与PBS轮流多洗洗
2..0.02-0.2M glycine,pH2-3＋(1-2% SDS,optional) +(3M NaCl,optional,反正就是高盐) +0.05-0.01% Tween 20,温度方面可以选择RT,也可以选择50-80度,一般30min;
3.yoyololo所说的方法.
不过一般最佳的stripping buffer推荐你买Pierce的Restore Western Blot Stripping buffer,其他杂牌公司的Stripping buffer不太保证质量
顶部
 18  2/2 ‹‹12