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标题:【求助】IPTG诱导蛋白表达的问题!

zhy平平[使用道具]
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【求助】IPTG诱导蛋白表达的问题!

各位战友,大家好!最近我用IPTG诱导蛋白表达,第一次诱导的蛋白表达出来了(诱导浓度是0.1mM)。接下来我就按照师兄的说法,把已经诱导出蛋白的菌液吸出5ul到一个含有5ml LB的试管中摇到OD大约为0.6到0.8的时候再取出一部分细菌裂解后鉴定诱导的蛋白是否在裂解液上清,结果不论是在沉淀还是在上清中都不出现诱导的条带了。然后我又把后来摇的这部分细菌全菌体跑了一次电泳,结果也没有条带了。我又重复了好几次都是这样。于是我又把第一次诱导后剩余的细菌再来跑电泳,还是和以前的一样有条带。师兄说可能是因为细菌状态不好了,让我重新再来一遍。但是另外一个师姐说细菌在4度冰箱里放几天一般都不会有什么问题,而我的细菌在冰箱里放了也就只有一个礼拜不到。我看到园子里有人说加过IPTG后的细菌质粒会丢失,所以我现在想问问我的细菌后来诱导不出蛋白了是不是因为以前加过IPTG诱导,所以后面再诱导就诱导不出来了?我现在已经被这个问题弄得焦头烂额了,希望有经验的战友能够提供一点意见,非常感谢!
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zhenxin[使用道具]
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这样的诱导表达方法可行,但不是每种质粒都能这样来。应该先按照一般的诱导表达程序做一次。
1) 复苏
2) 培养到 适当浓度时,OD 600 达到 0.5 左右,加入 IPTG 诱导。
楼主的表达程序似乎已经包含了这样的工作,也有表达,不是很好么。这个表达很可能依赖 IPTG 的高浓度存在,当 IPTG 浓度下降时,启动子会关闭。不像有的情况,IPTG 会留在启动子上,哪怕细胞分裂繁殖,IPTG 仍保留。
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zhy平平[使用道具]
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可能我没有说清楚,我是取出5ul到5ml菌液中摇到一定浓度时,再加IPTG到0.1mM诱导的,因为师兄说前面的菌液中IPTG已经稀释到很小的浓度了,所以可以忽略不计。
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utt0989[使用道具]
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按理说这样做也是可以的,我以前也这样做过,没有出现楼主这种情况。我怀疑楼主所表达的蛋白对宿主菌有影响,表达后菌产生某种变异或保护性机制,使用这种菌再做诱导时就不表达了,建议以原始菌种做诱导表达。
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youyou99[使用道具]
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重新来过,有时是没有理由的,找也找不出,只有重新做,很多人都遇到过.我觉得还是不同质粒的稳定性问题.
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hulu呼噜[使用道具]
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这很可能是诱导后的菌株产生了变化,做诱导表达最好用原始的单克隆菌株,我觉得你没有必要在这个问题上花费心事。
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OD在0.5的时候就要加IPTG了
另外,我一般都加IPTG后摇菌4小时后,当天或者次日全都裂解后,上清沉淀分别冻在-20度
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qianqin1977[使用道具]
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作为表达菌,最好每次表达前均用刚转化的表达菌,否则表达量很低。
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ending[使用道具]
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你诱导的之前每次都要测OD在值吗.到了0.5在加IPTG吗
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glass[使用道具]
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我觉的没必要每次作都测OD值吧!
按照经验差不多就可以吧
而且做诱导表达最好用原始的单克隆菌株
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