小中大【求助】western结果不稳定
最近做小分子蛋白的WESTERN BLOT，分子量为17KD，做了很多遍，总是能得到内参蛋白（TUBLIN，50KD）的条带，并且该目的蛋白的纯品（公司订购所得）也能得到条带，但是从细胞内提的目的蛋白的结果很不稳定，时有时无，都做了不下于50遍了，急得不行。步骤如下：
1 取1，000，000个细胞，细胞裂解液冰上裂解30分钟，冰上超声，280W，10下，12000转离心10分钟。放于—80度。
2 取20UL细胞裂解液，加入上样缓冲液，95度5分钟，点样。100V30分钟，150V30分钟。
3 NC膜（0.45UM），转膜缓冲液+20%甲醇，300MA2小时。
4封闭，37度1小时。一抗37度1小时，PBST洗30分钟，二抗37度1小时，PBST洗30分钟，曝光显影。
经常得到的结果是：内参有条带，目的蛋白的纯品（0.5UG）有条带，但细胞提的有时候有，有时候就没有。而这种细胞应该是固有性表达该目的蛋白。
是不是NC膜要买0.2UM的？转膜时间是否还要短一点？做丽春红染色，发现目的蛋白的纯品泳道上，NC膜背面的染色比正面要深。
