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标题:【求助】western 转膜条件（北京六一）

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发表于 2014-6-4 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 转膜条件（北京六一）

我的目的蛋白21kD。用北京六一厂电转仪（40D），湿转恒压100V 3h。预染marker在PVDF膜上清晰可见，但胶考染后仍可见蛋白条带，后续做Western无目的条带。请问我转膜条件有问题吗？另外大家用恒压转膜时，电流有多大？我放了冰，电流也有300mA左右（用的Bio-Rad电泳仪）。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-4 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电流太大了吧。用恒流转的话180MA 70min
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 小中大

那为什么还有条带没转过去呢？我用的恒压，没用恒流，为什么电流这么高？我也加冰了呀！
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-4 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电压可以再低一些，我们用70V恒压，电流最大没超过240mA
转后的膜有没有用丽春红染过，一般marker转过去了，蛋白也应该是转过去的。至于胶上仍有条带，可能是由残余，只要整体转的一致，所得出的结果仍然是有意义的
建议先用丽春红染膜看看有无条带，若无则转膜有问题，若有则可能是封闭或抗体等的因素
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 小中大

谢谢！那恒压70v 多长时间？我的目的蛋白21kD、34kD，内参蛋白（actin)42kD。
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jujuba[使用道具]
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 小中大

我们实验室一般用2-4h,视蛋白大小有所调整
建议2-3h,尝试一下，不同实验室条件可能要有所改变的。
转膜过程记得冰浴
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2541[使用道具]
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发表于 2014-6-4 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是我们实验室的转膜条件，由于不会做表格，只好做成图了
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发表于 2014-6-4 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 2541 于 2014-6-4 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这是我们实验室的转膜条件，由于不会做表格，只好做成图了

楼上提供的只是转膜时间。。。。电压和电流呢？采用多少？
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-6-4 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我实验检测的蛋白分子量为27KD及43KD，选用了80V恒压转移1.5小时至PVDF膜，转移中产热较多，故降温尤为重要。曾使用恒流30mA转移过夜，效果不佳，转移效率低。
请参考不才的心得:cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=7301200&sty=3')
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发表于 2014-6-4 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位！我重做了一次。转膜条件为80v恒压2h，一直放在冰浴中，我看了一下电流，没超过170mA。结果很好，用丽春红染色蛋白条带清晰，但胶考染后还是有残存蛋白。做后续实验，内参actin非常漂亮，遗憾的是目的蛋白没有条带。
分析原因可能是：1）目的蛋白表达低，我用的DAB显色敏感度不够。2）一抗质量。用的Santa公司产品，推荐1:200稀释。我一个同事做组化没做出来。
请问大家有什么意见？有没有做过乙肝病毒s抗原和c抗原的western 检测?
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