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标题:【求助】wesrern中的抗体放大效应

nvdabing[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】wesrern中的抗体放大效应


大家好。我刚刚开始做Western。有几个问题搞不明白，请大家帮帮忙。
1、我购买的单克隆一抗已经生物素化了，是不是就不用再用生物素化的二抗了，直接用抗生物素蛋白-HRP就可以了？那么，检测的灵敏度是不是会受到影响。
如果我再用生物素化的二抗与一抗结合，有没有必要，是不是这样灵敏度会大大提高呢？
2、我购买的抗体是针对203-705aa区域的，那么一些变异性的剪切，例如在300-400aa的isoform会不会同样被检测到呢？或者1-803aa的全长会不会被检测到？
请大家帮我看看，谢谢了先。
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发表于 2014-6-4 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗标记生物素,没必要再用二抗,应该用链霉亲合素和碱性磷酸酶,应用BCIP/NBT系统进行显色反应观察结果.
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 小中大

谢谢，那为什么不能用抗生物素蛋白-HRP，ECL发光呢。
还有第2个问题请高手来回答一下。
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 小中大

链酶抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶
是不是就是链酶亲和素—辣根过氧化物酶？Streptavidin horse radish Peroxidase,SP
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

链霉亲合素就是与生物素直接结合的天然蛋白,没必要去制备抗生物素的抗体.
链酶抗生物素蛋白,没遇到过这种叫法,估计应该是链霉亲和素.
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 小中大
以下是书上说的：
BAS-酶联免疫吸附试验是将生物素-亲和素（BAS）放大系统与ELISA结合起来的一种技术。生物素（B）是一种小分子的生长因子，有两个环状结构，其中一个可以和亲和素结合，另一个可以和包括酶、抗原（抗体）的多种物质结合。亲和素（A）又称卵白素，有4个亚基，都可与生物素稳定结合，此为放大系统的关键，即有1个亲和素就能结合4个生物素，亲和素也可被酶标记。
在BAS的应用中正是利用了生物素和亲和素的这些特点，设计了两类反应类型：一类是以游离亲和素为“桥”，分别连接生物素化抗原抗体反应系统和酶标生物素。此种类型有BAB法和ABC法，另一类是直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统，此种类型有BA法。以双抗体夹心法测抗原为例，各种类型的反应式表示如下。
BAB法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶＋底物。
ABC法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶-底物。
BA法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素-酶＋底物。
这种通过BAS放大作用可将更多的酶聚集在固相载体上，使酶免疫技术检测的灵敏度进一步得到提高
4生物素+ 1链酶亲和素-HRP+底物，怎么看也看不出是放大了，明明是缩小了啊，请高手解释一下啊。
虽然我做的是Western，但是原理应该一样啊。
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发表于 2014-6-4 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Western比酶联免疫吸附试验要简单的多,你要做Western的 话建议你看关于Western方面的参考,不要把简单的事情搞复杂了啊,但是你的一抗是带生物素的,你用的二抗就必须带抗生物素蛋白,比如用链亲和素标记的HRP,AP,都可以,AP过程简单,成本也很低,HRP的显色底物有剧毒哦
而且你是做什么的啊,为什么有蛋白区域特异性的抗体呢
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nvdabing[使用道具]
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 小中大

我做的这个膜蛋白有不同的剪切形式，目前还不清楚到底有几个不同的剪切。
全长是1-803aa，这是未成熟的状态，大概只能表达24小时左右；
蛋白成熟后会把前段的信号肽和前导肽剪切掉，大约200个aa，然后就是剩下的201-803aa的成熟蛋白。其中201-702aa为细胞外结构域。推测有分泌型蛋白。有针对201-702aa的细胞外功能区的抗体。检测分泌型蛋白。
有针对201-797aa的全长抗体。
702-797aa为跨膜域和胞内域。
也有针对702和797aa的抗体。
第2个问题谁来回答以下阿，谢谢。
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