蛋白质与蛋白组学

大家好：
本人做了三个月的WB了，一直都做的不好，不只经常不出来条带而且最近新买了两个抗体做了好几次了居然都还没有出来过结果，很郁闷啊!古人云：磨刀不误砍材工啊！所以想把自己的条件及方法具体的拿出来让高手们看看出出主意。
我的目的蛋白是细胞因子IL-2,IL-6,TNF，分子量都是只有20左右。组织匀浆配方三去污裂解液加PMSF冰上裂解后离心12000转5分钟后100度水煮分钟变性，测蛋白浓度大致都为10微克每微升，蛋白上样50微克，2*的loading buffer，分离胶浓度为12％（水3.4ml，30％Ar/Bis 4ml，tris 2.5ml,AP100,10%SDS100,TEMED4)浓缩胶为5％(水2.7ml,30%ARr/bis670,tris 500,AP40,10%sds40,TEMED4)电泳80伏半小时后用100伏跑到溴分蓝快跑出来时停止电泳（我的溴分蓝总是跑的不是很直）。转膜用的时NC膜0.45的孔径，350毫安1个小时，后用脱脂牛奶封闭2个小时加一抗过夜，一抗用的是santa cruze的多克隆抗体浓度是1：1000，过夜后用TBST洗三次每次10分钟后加二抗浓度是1：10000，37度一个小时，再用TBST洗三次每次10分钟后，ECL发光，膜上全都是荧光不是成条带状的荧光，是一片一片的杂乱的荧光，没有条带。
谢谢各位高手帮忙分析分析，指点指点，感激啊！好人！

[ 本帖最后由 junjie05 于 2014-6-4 17:27 编辑 ]

非常感谢各位的帮助！你们的话给了我很大的鼓励啊特别是踏雪无痕这么仔细的解答真是很感动！还有两个问题想请教你：我的溴分蓝每次都跑的不是很直，气泡我都赶了的不小的是什么原因。还有就是我转膜后用丽春红染色后的条带都不是很浓也不是很清楚，有的清楚而有的就是红的一片，每次转膜后我都快没有信心继续往下做了，乌乌乌！用ECL曝光了肉眼就可以看到到处是荧光一托一托的荧光但是就是没有象条带状的荧光，用片子暴了都是黑乎乎的一片，不过ACTIN到是暴的还可以

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1.溴酚蓝跑得不直：可能原因有:一要胶没有充分混匀;二是有气泡；三是浓缩胶的宽度（跑胶的方向）可能有些窄，没有充分压缩；我觉得前两个原因是主要的，特别是第一个，加胶前要充分混匀，加样前要充分凝固（不要刚凝马上就加）。
2.丽春红染膜后的问题：我觉得很可能与你的一抗是多抗有关，产生了非目的蛋白的干扰，封闭的时间也可以了，一抗稀释液最好也用封闭液，如果还是不行建议你最好买个单抗试试看。