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标题:【求助】WESTERN高手帮帮忙，给分析一下原因,万分感谢！

niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WESTERN高手帮帮忙，给分析一下原因,万分感谢！


做了近半年wstern了，但是不知道为什么，总是做不好。一开始是出不来，显色是一片空白。现在是第一：有时可以出来，又时出不来。出来结果的时候，条带挺漂亮的，不出来的时候就什么也没有，背景都没有。第二:同样大小的两个蛋白，一块跑胶，一块转膜，总是一个出来一个不出来（可以肯定非抗体问题，因两个抗体都做出来过）。第三，同是我师兄操作，一块转膜，怎么我的转膜效率没有我师兄的效率高？
这一蛋白量western方法我师兄做的很成熟，但是到我这就是老出问题，各位高手给分析一下，我究竟是哪一步出问题了，小女子不胜感激！
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是我出问题的地方会很多阿？还是我的问题各位高手也不知道如何下手分析？麻烦各位给点意见，我实在是不知如何下手了，不是哪一步，那些步骤可能有问题也行啊。我实在是无路可走了。麻烦各位指点一二，万分感谢！
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ero11[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题不够具体．但是你有个同样在做ＷＢ的师兄是非常幸福的．你可以把你的药品和操作和他的进行仔细的比对，应该能找出差异来．如果有不懂和不清楚了，那就虚心请教了．这比网上请教来得快哦．
ＷＢ我也在摸索中．如果有问题，请详细点，大家共同探讨探讨．谢谢
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feima+[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我刚刚作出来,结论是必须仔细些,不能马虎.先验证一下有没有转印成功,氨染一下就好了,另一部分膜继续做下去
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发表于 2014-6-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近要做一个蛋白表达的分析,请问大家、专家谁能指点一下是用WB好，还是用免疫组化好，我是这方面的新手，还没有接触过这样的实验，多谢了 ！
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，如果能找出差异，我就不在这里问了。我跟着他做过两次了，所有条件照搬，但就是不稳定，我在这里问也是没办法的办法。
同样大小的两个蛋白，一块做，一个出条带，一个不出，这是转膜的问题吗？我觉得不是。一开始觉得是加抗体的因素，但现在又觉得不是。真不知怎么办了，想着是否要放弃了。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你觉得不是转膜和抗体的问题,
那你就留意下你的ECL发光剂和显影液的问题.
我师姐暴光之后没有条带,有时还条带中空,换了ECL条带就出来了很漂亮.
还有一次也不出带,后来知道显影液和定影液用的时间太长了,不WORK了,新配之后就OK了.
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

和我曾经遇到过的问题一样，我也曾经饱受折磨半年，我觉得最大的问题不是操作的问题，而是你转到膜上的蛋白质量不够（表达量太低）啊，或者使用的显色剂的灵敏度不够
1。我觉得你可以先用ELISA 或DOT BLOTTING 分析 看看你的样品是不是有目标蛋白质
2 。加大SDS-PAGE 时的上样量
3。使用更灵敏的显色剂
我的问题就是这样解决的
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也碰到过类似的问题，做得好好的实验，重复第二次或第三次，就不出条带了。蛋白和抗体及条件都没变。我自己体会，可能有以下原因：
1。转到膜上的蛋白质量不够
2。抗体失效（但似乎太快了点，昨天还出带的）
3。发光液加得不匀
虽然列了以上原因，但我觉得这几点我好像都没做错，我也很困惑啊！希望大家也帮我分析一下
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-4 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的解答，我这几天一直在考虑，结果的好坏是不是与胶的配置和电泳有很大关系？上面几位提到的问题我曾经注意过， 以后操作会更加小心，谢谢！我不知道它与胶的关系有多大，现在我准备把配胶那一套换换看，是不是有改善？谢谢大家的关注，谢谢
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