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标题:【求助】SHG-44 2-DE银染

bongte[使用道具]
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发表于 2014-6-5 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SHG-44 2-DE银染


收集SHG-44细胞后,用PBS洗涤后离心收集,然后加PMSF,用9.5M尿素,4%CHAPS,1%DTT,0.4%Bio-Lyte 3/10,裂解10min,超声处理30s(间隔5s,超5s,共3次),25000g冷冻离心15min,取上清,经Clean-Up后,直接上样IEF.
IEF中,电压上不了8000V,先老是在7000V上下波动,后阶段一直维持在7300V左右,IEF聚焦总共56000Vh.因为时间原因,IEF后IPG胶条用保鲜膜包好，于-80℃放了1.5d,SDS-PAGE胶配好凝固后在4℃冰箱中也放了1.5d.
跑完二向后,快速Ag法然色后结下图,问:为什么酸性端和碱性端的大分子量端有这么多竖条纹?


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2014-6-5 17:45
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发表于 2014-6-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 盐离子影响不大,7300v聚焦到56000vhs也可以.竖条纹可能和平衡时间过长有关,17cm不能超过15min.
2. 另外,在一向转二向时也有影响,要使胶条与胶面接触紧密并且尽量避免气泡.
3. 胶条放-80℃可能也对二向有影响,最好连续进行实验.
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发表于 2014-6-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据文献报道，用普通裂解液裂解细胞的话在碱性端会出现水平条纹的。
你7000V聚焦时电流大概是多少？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-5 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白点出现一些纵条纹，与一向到二向的蛋白转移有关，还有可能是上样量偏大，还有可能是灌胶的Buffer浓度有偏差。
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bongte[使用道具]
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发表于 2014-6-5 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的聚焦电压设置为8000V,聚焦实际只有7000多V,所以电流是最大值50uA;
我的蛋白没有进行电量(怕麻烦,下次一定定量),直接取来就上样了，哈哈~估计是上样量偏大了,Ag染的时候很快就有spot出现了~~
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-5 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实际上你的电泳图谱已经很漂亮了，你的要求也太高了，哈哈
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bongte[使用道具]
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发表于 2014-6-5 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
做科研就要精益求精呀~~~满足现状那是要不得了，哈哈,不知道我说的对不对呀
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-5 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说得非常对，不满足现状，前途不可限量。以后要多交流啊，哈哈
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-6-5 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量太高了,其实这样的拖尾在考染的制备胶中很常见(考染制备胶上样量为2mg),另一种情况在GE公司的manifold上样方法中也会出现(正常银染上样)
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-6-5 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外有个小建议:你停下的福特小时可以再优化下,感觉点不是很圆,标准以高电压降到最小电流维持1h为嘉,总的来说这张图比较漂亮Smile
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