蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】请大家帮我分析一下这张2-D图是什么问题啊

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】请大家帮我分析一下这张2-D图是什么问题啊

popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
1

发表于 2014-6-7 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请大家帮我分析一下这张2-D图是什么问题啊


我跑的是PH3－10，NL，24cm，这次电压一直上不到8000V，跑到5500V时电压就很难上去了，最后跑了30h，终电压才6100v。我的蛋白样品是透析后沉淀的，盐离子不可能高。蛋白上样量是150µg，其中有两个样品上样量有点低，在80µg左右。结果六块胶在酸性端上方均有蛋白聚集。想请大家帮我分析一下会是什么问题啊，和提取的样品有没有关系。谢谢了！


查看积分策略说明
附件
2014-6-7 09:26
74353250.snap.jpg (37.03 KB)
 
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
2

发表于 2014-6-7 09:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电压上不去，可能是所含两性电解质浓度过高，比如biolyte，pharmalyte，IPG buffer浓度过高，都可能引起电压上不去！
24cm，150ug，上样量并不算大，但是蛋白聚集，是不是因为变性不够？裂解液用7M尿素＋2M硫脲效果比8M尿素好，因为硫脲可以帮助许多难溶的蛋白溶解。另外，二向前平衡时，DTT的量是不是够？
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
3

发表于 2014-6-7 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的裂解液是用8M的尿素，确实没加硫脲，IPGbuffer加的是0.5％，二向前DTT的量应该是够的。
我用裂解液溶解了沉淀蛋白后，在常温放了半小时，然后离心的。是不是时间还不够呢？看来得用7M尿素＋2M硫脲再做做看了。
顶部
bling[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77268
精华 0
积分 383
帖子 486
信誉分 100
可用分 3216
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
4

发表于 2014-6-7 09:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

文献中报道，硫脲干扰第二向电泳。
你用的是银染吗？否则的话，我怀疑你的定量Kit的有效性。
如果其他的试剂都正常的话，如果电流太高，可以说是样品盐浓度的问题了！
不知道你用的什么方法提取的？
顶部
glass[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76223
精华 0
积分 715
帖子 1109
信誉分 100
可用分 6373
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
5

发表于 2014-6-7 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是杯上样还是胶内进样?阳极模糊,可能是核酸的干扰,同时会影响聚焦,问一下你的样品制备过程.
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
6

发表于 2014-6-7 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你聚焦不完全，可能还有一些核酸污染。建议样品细胞破碎的时候超声一下。
顶部
popo520[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 103468
精华 0
积分 269
帖子 257
信誉分 100
可用分 2066
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
7

发表于 2014-6-7 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你们，我提取的是培养液中的分泌蛋白，通过透析和沉淀法提取蛋白的，然后沉淀蛋白直接用裂解液溶解，应该不需要超声吧。我透析都超过24h，盐离子不可能高的。
IEF是采用胶内上样的，蛋白定量应该不会有问题，我用的是银染。
希望大家帮我发现一些问题，老板催的急啊，日子过的不爽啊！
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
8

发表于 2014-6-7 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.从图谱看，可能是核酸的影响，你加DNA酶和RNA酶没有？
2.你说酸性蛋白聚集，会不会是你的酸性蛋白比较多，你可以把你的IPG改为pH4-6的试试。
3.电压上不去，我们也曾遇到过，主要原因是样品中盐离子浓度过大，也是通过层吸柱收集的蛋白。而且你的试剂中会不会盐离子太多了，建议主动水化。如果各方面都没问题，那就是仪器的问题了，当初我们也是最后才发现可能是仪器的问题，修理后就好了。还有温度你注意了吗？
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
9

发表于 2014-6-7 09:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是什么沉淀法?丙酮沉淀吗?TCA有没有洗去?丙酮有没有充分抽干?这些可能会影响,分泌蛋白不存在核酸干扰.
顶部