【求助】IEF电压只有12V!!!一直不上升,大家帮帮忙

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标题:【求助】IEF电压只有12V!!!一直不上升,大家帮帮忙

veiwu[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品用试剂盒提的,根据试剂盒指示,样品可直接用于双向电泳.
我又用旋转蒸发将其浓缩了一部分,再用水化液溶解了才上样的.
仪器是GENOMIC SOLUTIONS的,设置为25000VH,9.5H,可跑了快一天了,电压仅仅有11-13V,根本上不去.盐离子用超滤的方法除了.以前盐离子浓度很高时,电压也有几百,不可能这么低.阳极滤纸有些变黄,胶条上的溴芬兰一点没跑.
这些样是我一两个月以来提的,十分珍贵,可能已经无法挽回了.但是希望大家给些建议,我以后的实验好再摸索.谢谢

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是两极的滤纸没有压到胶条介质上？有时压的不紧也会升不上电压。

yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

样品用试剂盒提的,根据试剂盒指示,样品可直接用于双向电泳.
你又用旋转蒸发将其浓缩了一部分,再用水化液溶解了才上样的.
仪器是GENOMIC SOLUTIONS的,设置为25000VH,9.5H,可跑了快一天了,电压仅仅有11-13V,根本上不去.盐离子用超滤的方法除了.以前盐离子浓度很高时,电压也有几百,不可能这么低.阳极滤纸有些变黄,胶条上的溴芬兰一点没跑.？？？？？你的具体问题我没搞明白？
我建议可以检测电导率总离子不超过20mM 最好上样一般不会有问题的
加离子纸片效果还可以时间久点据你所说的应该是离子太多
样品要用缓冲液置换好你的试剂盒提取得溶剂同时你计算下离子的总数
我具体不知道你的试剂盒是怎样的哦？是只提取蛋白呢？还是在提取的时候已经裂解蛋白了只要你测蛋白质浓度就可以直接上样最多再加点两性电介质等等

remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好在看看你的电流的量，如果是电流也很小甚至为０的话，你就应该看看你的胶条是否受到破坏而引起的短路情况了！我遇到过这样的情况！我觉得其他的原因，比如离子的浓度一类的原因虽然可以导致电压升不上去，但电压不会象你的这样低，况且你用的还是试剂盒！

莲花白[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我个人觉得,你的样品处理后是否还存在??应该在跑电泳前定一下上样量,如果没有问题,接着考虑上面各位所提的建议.

jujuba[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也出现了差不多的情况，我在IEF聚焦时电压也只有在2200－3000V左右，也一直上不去，就是不知道什么原因。一般来说聚焦过程中电压上不去就是因为样品中盐离子浓度太高，但是真核细胞应该没有多少盐分，而且我在裂解过程中也没有加入盐离子，请遇到过相似问题或知道怎么回事的大虾给点意见，我都快急疯了。
具体参数：
真核细胞
7cm 胶条 PH3－10
裂解液：7M 尿素，2M 硫脲，4％ CHAPS,1% DTT,5％ IPG BUFFER
水化液：7M 尿素，2M 硫脲，2 CHAPS,1% DTT,5％ IPG BUFFER
裂解方法:将贴壁细胞用生理盐水洗后刮下，离心后吸干上清，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，超声裂解，12000转离心，然后测蛋白浓度后根据上样量加入水化液再次12000转离心，在进行被动水化。
IEF 条件：50V 1h
150V 1h
250V 1h
500V 30min
1000V 30min
8000V 2h
8000V 25000vhs
但是聚焦根本到不了8000V，做了几次都只在2500V左右就上不去了，同时电流也下不来，在50uA,请各位帮帮忙看看！

xyw5[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将样品丙酮沉淀后再用2D buffer溶解

IAM007[使用道具]
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发表于 2014-6-7 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

生理盐水洗下来后，离心吸干上清？我觉得上清吸不干的，然后，你裂解液加的有多少微升呢，加的少了残余的盐离子可能也会有影响的

婴儿脸[使用道具]
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