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标题:【求助】超滤，电泳后的问题

youyou99[使用道具]
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发表于 2014-6-7 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超滤，电泳后的问题


我的样品经过5KD的滤膜超滤后，上清液和滤液都跑了tricien-SDS-PAGE，发现上清液条带很模糊，滤液条带很清晰，但神奇的是，滤液理论上来说，应该是样品中分子量小于5KD的那部份，但条带的位置，居然在分离胶的上半部分，而上清液的条带位置反而靠下，也就是说，滤液中的蛋白分子量比上清液中的分子量大？？！！
电泳条件：分离胶12％，浓缩胶4％，80V恒压电泳。
对了，样品之前经过酶解，用NaOH调过pH值，所以滤液中应该有一定量的NaOH，应该说，浓度也不低。
大家救救我吧～～
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-7 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的滤膜有问题吧？
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jkobn[使用道具]
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发表于 2014-6-7 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

滤膜没问题，师姐用过很正常。
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yapuyapu[使用道具]
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 小中大

凝胶浓度可能低了，用15%的分离胶试试！
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分子量不同的蛋白应该用不同浓度的分离胶来跑！
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的蛋白在超滤的时候是没有变性的，也就是说上清中的蛋白可能是以多聚体的形式存在，所以分子量较大，跑tricien-SDS-PAGE电泳的时候你的蛋白是变性的，有可能出现你说的情况，你可以跑个非变性电泳验证一下看看。
祝你实验顺利！
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发表于 2014-6-8 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2014-6-8 10:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的蛋白在超滤的时候是没有变性的，也就是说上清中的蛋白可能是以多聚体的形式存在，所以分子量较大，跑tricien-SDS-PAGE电泳的时候你的蛋白是变性的，有可能出现你说的情况，你可以跑个非变性电泳验证一下看看。
祝你实验顺 ...

我赞同。另外，在跑tricien-SDS-PAGE电泳的时候，你不加巯基乙醇，看看有没有什么不同!
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发表于 2014-6-8 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
巯基乙醇是主要作用是打开肽链内部以及肽链间的二硫键，如果蛋白不存在链间二硫键的话，用不用巯基乙醇蛋白条带在SDS-PAGE中的位置看不出明显的变化，我做过类似这样的对照实验.
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一个问题，PVDf膜在使用之前必须用甲醇润湿，为什么时间不能超过15秒呢？
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一下,你的超滤膜是在哪里买的?我现在也在跑小分子蛋白的电泳,但是样品杂蛋白太多,效果不理想,可以与你交流一下吗?
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