【求助】200ug 的上样量, 怎么2-D 胶上没有点呢?

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标题:【求助】200ug 的上样量, 怎么2-D 胶上没有点呢?

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的样品是来自于细胞分泌的不溶于水的物质, 用4% CHAPS, 8UM Urea的lysis buffer , 超声粉碎, 然后离心取上清, 蛋白定量后取200UG的上样量, 用sliver-blue方法染色, 基本上没看到点,只有一些竖条纹,而且还不是垂直的, 我以前用同样的样品能看到点的. 不知道有没有人碰到我这种情况. 我现在多害怕做2-D 了, 时间长, 作完后效果不好, 伤心啊! 还有,我用这个样品跑SDS-PAGE, 1-D, 也是看不到条带,会不会蛋白降解了?

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚刚说了,我这个样品来自于细菌分泌的不溶于水的产物, 那除了CHAPS ,UREA, SDS, TRITON X-100 AND TRITON X-114 之外,还有哪些可以溶解蛋白质的试剂, 然后做SDS-PAGE的. 我用过以上的试剂,多不能完全溶解我的样品, 老板催着我要结果,但是不溶解的话,我怎么得到蛋白条带啊? 我也用甲酸, TFA 等溶解,但是也不能完全溶解. 而老板偏偏就关心不溶解的部分. 急死了.

49888[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多少cm的IPG Strip呢,200ug对于silver blue法感觉量偏少了~~~我一般Silver-blue法的上样量和传统考染的量相差不大~~

orangecake[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多少CM的胶条200UG对于银染都挺多的,你这个问题是不是那些蛋白根本就不溶所以染不出来呀?

831226[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家在跑第一向之前调整样品的pH 值吗？？如果要调整，不同范围的胶条分别应该调整到什么样的pH比较合适？？

glass[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

200ug对silver blue来说应该足够了，按照楼主的说法，也不是没有点
而是出现了竖条纹，更多的可能是蛋白提取步骤出现了问题
建议重新配置所有的裂解液。
To sagily，偶是从来不调整样品pH值的，实验室一般都开始用24cm, pH3-11的胶条跑，如果发现样品在4-7范围，在改成pH4-7的胶条跑

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位的建议,我的是13CM的胶条,样品没有调PH. 后来仔细看,终于能看到几个点, 也许样品中的蛋白种类本来就不多吧? 下次用银染看看点是否多些. 一般用考染的话,13CM的胶条,上样量多少?

蒲公英[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用考染的话，13CM的胶条,上样量可能需要750ug左右，银染的话200－300ug足够了，要不然点会太浓，效果不好。

remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

silver blue你自己真的做起来的话没文献中说的那么棒,估计上样量和常规考染的量差不多了~~~