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标题:【求助】IP遇到困难！

bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】IP遇到困难！

细胞用lysis buffer（含8M的尿素）裂解，再用RIPA稀释10倍，500ug提取物进行IP，用法码西亚的Protein G提IgG，western后，发现直接上lysate（50ug）的lane有目的条带，IP泳道只见很浓的IgG条带。连续作了几次了，增加了抗体的用量，还是不行！目的蛋白大小190KD左右。现在考虑是不是RIPA里面的detergent太多(1%)，用的是TRITON X100。
请高手给点建议，不胜感激！
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

8M urea 可能有一定影响！
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bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是我用RIPA稀释了十倍啊，而且是参照文献做的！
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bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
调整RIPA，降低detergent到1％，出现很多非特异条带，当然也有特异带，很弱，怎么办呢？
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为什么要用含尿素的LYSIS BUFFER 裂解细胞,为什么不直接用RIPA裂解细胞?
LYSIS BUFFER中盐浓度太高的话会影响结合力的
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.细胞裂解前有经过交联么？否则很难抵抗８Ｍ尿素.
２.蛋白是否会有降解！
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接用1*的RIPA裂解细胞，有需要的加上蛋白酶抑制剂
注意你的PROTEIN G的来源种属，人，鼠还是羊，一定要注意，不然的话，你用再多也不会沉淀下来。
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发表于 2014-6-8 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是根据文献上来的，应为前面的lysisbuffer里面还有对蛋白进行修饰的成份，IP下来后质谱分析。细胞里蛋白没有经过胶连的。PROTEIN G：Recombinant protein G, Mr 17 000, from GE Healthcare is produced in E. coli
and contains two IgG binding regions. The albumin binding region of native
protein G has been genetically deleted, thereby avoiding undesirable crossreactions
with albumin. The pI of of protein G is 4.1 and the pH stability 2–10.
protein G应该没问题的，安法码西亚的，对兔源性抗体的结合力是＋＋。
谢谢各位啊！ 有什么好建议再提出来，感谢！
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

查看一下你用的抗体的说明书,买的抗体(包括自己免疫兔子得到的)有的是不适合做IP的.你直接用RIPA来裂解细胞,做IP.看看能不能拉下目的条带,如果能的话,说明抗体是可以做IP的,问题可能就出在前面的缓冲液中,如不行,换个抗体试试
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bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-8 10:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

改用了weak RIPA，出来了一点条带，非特异条带不少，但是在延长preclear时间到2小时，4度，抗体作用时间4度过夜以后，目的条带没增加反而减少，连反应后的上清里面的目的条带都消失了，不知道到哪里去了，有没有可能4度用beads preclear时，把我的目的蛋白preclear走了，这个protein G的结合特异性这么差么？请大家救救命啊！
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