【求助】westernblot的非特异条带

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标题:【求助】westernblot的非特异条带

寻梅[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位前辈，向大家请教一个问题，如题。为了说明问题，下面我先介绍一下我的westernblot流程。
1 蛋白样品：RIPA裂解液裂解后保存于－80度，约3个月，我的目的蛋白为21kd
2 上样：按50ug每孔上样，5xloading buffer已经加入DTT
3 电泳：15％的胶，浓缩胶80v，分离胶120v电泳
4 转膜:0.45um的膜，按常规操作。100v转25min
5 丽春红染色：我没有见到我需要的目的蛋白染上色，但40kd以上的看到了。
6 一抗：sc产品，多抗，1：100稀释，4度过夜
7 二抗：sc产品，1：500稀释，室温一小时
8 洗涤
9 ECL发光压片30s后在40kd左右见清晰条带，但21kd处未见，将压片时间增加至10min仍未见。
我想请问为什么我的目的条带不显色，如果没有转过去也不应该在40kd处显色啊？是不是我的蛋白放太久呢，还是裂解液的问题，请各位帮忙看看，真的谢谢了，十一在际，希望大家实验能顺利点。

u234[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以换种孔径小点的膜试一试。
应该不是你说的那种原因，可能是你操作的原因！

寻梅[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢回复。当时定膜没有留意那么仔细。为什么是孔径的问题呢，还盼解释

wood533[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

孔径的问题有可能，但是原则上，可能性不大。我也出现过这样问题。
我觉得可能有以下原因：
１、要排除胶的问题，因为胶不会，就会使得你的蛋白跑出来出现异常。解决的办法：做个marker，观察对照。
２、排除其它操作问题外，可以选择１２％的胶，比较一下，同时别忘了同时跑marker。
这样对照应该可以照到原因。祝实验顺利！

寻梅[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也想做做10－12的胶，希望不是蛋白样品的问题，谢谢了！

remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SC的抗体有的不是很好，如果你21kd附近背景很干净的话，提高一抗浓度试一下。

寻梅[使用道具]
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