【求助】第一次跑的Ag染

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标题:【求助】第一次跑的Ag染

junhun[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一次跑的Ag染,条件:Clean-Up后上样量220ug,17cm pH3-10胶条
IEF条件:主动水化50V 15h;S1,250V线性30min;S2,1000V快速1h;S3,10000V线性5h;S4,10000V快速40000V.H;S5,500V保持.
SDS-PAGE:加低熔点Agarose时溶化不充分,导致IPG胶条上方的Agarose凝固后带了若干个气泡(IPG胶条与SDS-PAGE的gel接触紧密,无气泡).
Q:为什么我的Ag中间区域这么beatiful,而酸性端与碱性端有这么多的横纹?
求高手指点一二.

附件

2014-6-8 11:24

30410280.jpg (52.38 KB)

avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.聚焦时间不够引起的，因为你17cm胶条10000v只聚焦到40000vhs，显然不够，应该在80000vhs左右。
2.可以在1000v-10000v之间再加两个梯度，这样效果会好些，
3.根据你的样品定量确定上样量，一般银染130ug左右，从图上看上样量还可以。

junhun[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上的朋友
1.对于聚焦时间,我做实验前,打电话向Bio-Rad公司的负责蛋白质组学市场的技术员咨询了一下,我本来聚焦时间是通用的推荐的60000Vhs,但他说这个很容易造成DTT的消耗,他说40000Vhs就够了,就改用了40000Vhs了;做完最后染色后,我专门叫他过来看了一下gel和扫描后的imagel,他的建议是把聚焦电压从10000V改为8000V,仍然40000Vhs.
2.1000V-10000V之间的梯度如何设置?slow,linear or rapid ?
3.Ag染时专门请了2-DE高手来监督,她说这个显色时,点出现的太快了,估计是量真的太多了(本来是想使用Blue Silver G-250 CBB染的)
不知道各位2-DE师兄师傅还有什么建议吗?

avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 8000v和10000v差别不大，主要是聚焦程度，40000vhs可能对一些样品来说足够了，但对你的样品不够，一般聚焦不能低于60000vhs。DTT的还原效果较强，基本上你混合进去没多长时间就还原结束了，无所谓消耗。
2.可以加2000v，linear;5000v，rapid;
3.点出的快慢和上样量关系不大，正常情况银染是所有点一起显现；上样量过大的话，显色会出现一团一团的，轮廓模糊，而且会影响低丰度蛋白的分离，从你的胶上看，上样量影响不是很大，这和你的蛋白浓度有关。

junhun[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:25 资料个人空间短消息加为好友

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3X a lot!

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:26 资料个人空间短消息加为好友

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QUOTE:

原帖由 junhun 于 2014-6-8 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一次跑的Ag染,条件:Clean-Up后上样量220ug,17cm pH3-10胶条
IEF条件:主动水化50V 15h;S1,250V线性30min;S2,1000V快速1h;S3,10000V线性5h;S4,10000V快速40000V.H;S5,500V保持.
SDS-PAGE:加低熔点Agarose时溶化不充 ...

你好：
我想问下银染你是用什么容器染的阿，大胶没有合适的使用与做银染的容器阿

junhun[使用道具]
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发表于 2014-6-8 11:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们用从隔壁实验室借来的定做的玻璃缸．我们实验室起步不久，容器染缸已经订做了一批，是23.2cm*23.2cm*5cm的有机玻璃,80元/只,下周四就可以到了.请问,有机玻璃和一般玻璃都适用于Ag染吗?

8princess8[使用道具]
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taoshengyijiu[使用道具]
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