【求助】非变性凝胶蛋白电泳图片分析

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标题:【求助】非变性凝胶蛋白电泳图片分析

wiwi[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人实验的目的是想通过非变性聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳来区分变性和复性的样品，大致想得到哪一种复性效果较好些。样品的PI为5.8-6.6。
做的非变性聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳，浓度为10%的胶,，没有制备浓缩胶,直接使用分离胶，样品的分子量为18K左右，制胶过程中，没加SDS，跑胶过程中在电极缓冲液加了一些巯基乙醇，电泳缓冲液使用了Tris-Glycine缓冲系统,PH为8.9，上下槽使用一样的缓冲液，跑胶在冰上进行，可以保持在15度以内，上样缓冲液有PH为8.9和6.8，跑胶的结果见图片。
1号泳道为复性液含有吐温80，2号泳道为复性液含有Triton-100，
3号为盐酸胍变性液，4号泳道为复性液含有35%甘油，
5号泳道为复性液含有环糊精，6号泳道为复性好的纯品样品，1-6号样品的上样缓冲液PH为8.9。7号泳道为复性液含有吐温80，8号泳道为复性液含有35%甘油，9号泳道为复性液含有环糊精，7-9号样品只是把上样缓冲液PH调为6.8。而跑出结果见图片，不知道为什么，连一点不整齐的带都没有，希望得到大家的帮助。

附件

2014-6-8 15:42

32427475.snap.jpg (18.67 KB)

xue258[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的非变性聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳指的是加尿素的胶吗?还是?

wiwi[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

没加尿素了尿素是变性剂肯定是不能加了

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.我觉得还是应该加上浓缩胶，这样更利于蛋白带的成型。
2.感觉样品液中有不溶性的东西，稍微离下心取上清试试。
3.缓冲体系估计有问题，分离胶中的PH=8.8，浓缩胶PH6.8，上样缓冲液PH6.8
电极缓冲液tris-glycine体系。
4.还有可能就是你做的这个模型，不知道这些变性液，复性液对缓冲系统有没有影响。
建议严格参照《蛋白质电泳技术》郭娆君编，中非变性胶的方法，本人做过，效果很好。

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发表于 2014-6-8 15:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上能否把你做的图片发出来看一下多谢了其实那些那本书我也看过就一直都没做好改了好几种方案没什么进展

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发表于 2014-6-8 15:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

能否发下你做的图片给我看一下多谢了都离心了 , 最主要的是6泳道了可是纯品只有一条带结果跟其他都没什么差异所以根本说不清楚是什么原因上样缓冲液的PH6.8和8.8 都做了从图上看结果几乎没什么差异

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个图跑的也不是很好，勉强可以看吧，Marker用错了，用成变性的了，没跑开，前几道是酶切后的BSA，后两个是纯品。
如果照你说的话，就是你用的那些变性液，复性液的影响了。

附件

2014-6-8 15:58

45011324.jpg (68.1 KB)

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非变性PAGE跑出的条带本来就没SDS－PAGE好看，它没有消除电荷的影响，很可能条带略成弥散状。外，还有如下可能：
（1）复性后的溶液成分复杂，单体蛋白，聚合蛋白等，离心，是否转速不够？我的复性液一般是浑浊的。
（2）含高浓盐成分在SDS－PAGE中跑的就不好，GdmCl或许也会影响。
（3）表面活性剂是否有影响？
（4）浓缩胶还是要得，效果明显。
也可同样样品在SDS－PAGE上跑跑看啊。

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发表于 2014-6-8 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人觉得：
一是非变性PAGE系统没有建好，
二复性样品中溶液比较复杂，影响跑胶。

DONT[使用道具]
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发表于 2014-6-8 15:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

低电流，加sds,不加任何还原试剂。浓缩胶可以没有。盐影响很大！