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标题:【求助】蛋白纯化出现问题

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发表于 2014-6-8 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化出现问题


最近,我用pET-32a载体表达25KD的蛋白,载体本身20KD,经鉴定目的蛋白存在于包涵体中,在纯化过程中,先用pH为8.0的8M尿素,0.1MNaH2PO4,0.01MTris-cl超声破碎15min,本以为再用pH梯度将目的蛋白最后洗脱下来,可是发现目的蛋白基本没有挂柱,而又用抗HIS的一抗做WB发现也没有问题,但就是目的蛋白不与镍柱结合,镍柱为Novagen公司,柱子本身应该没有问题,可问题出在哪一步,敬请各位高手指点迷津,急切盼望中.....
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发表于 2014-6-8 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要是确定目的蛋白在包涵体内，可以用非变性buffer重悬菌体，超声波破壁，收集沉淀，然后用尿素变性。避免一上来就用尿素的话，很多本来可溶的蛋白也混进来。
HIS-蛋白 挂柱后，用含高浓度咪唑的buffer洗脱蛋白质。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-6-8 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
收到,我还是个新手,许多问题不是很明白,但具我所之咪唑浓度梯度不是洗脱可溶性蛋白的吗?我用尿素挂柱后,洗脱杂蛋白还用咪唑吗,您的意思是建议我我不用PH梯度是吗,那尿素和咪唑混用不相互影响吗,十分感谢!!!!!!!!!!!问题是不是太多了,呵呵
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发表于 2014-6-8 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2014-6-8 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
收到,我还是个新手,许多问题不是很明白,但具我所之咪唑浓度梯度不是洗脱可溶性蛋白的吗?我用尿素挂柱后,洗脱杂蛋白还用咪唑吗,您的意思是建议我我不用PH梯度是吗,那尿素和咪唑混用不相互影响吗,十分感谢!!!!!!!!!!! ...

实在抱歉，我前面的帖子回答是有问题的。
1
首先要确定的问题是，蛋白质是没有挂柱还是没有洗下来，用 SDS-PAGE 检查每一个步骤。
2
用下面的buffer 洗柱：
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris·Cl
8 M urea
Adjust pH to 5.9 using HCl.
假如蛋白质是多聚体，复合物，双 His tag ，结合牢固，则可以使用下面的 buffer
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris·Cl
8 M urea
Adjust pH to 4.5 using HCl.
pH 一定要在使用前调节。
3
最后，我始终认为，应该先收集包涵体，去除细胞裂解产物中的可溶成分以后，再用尿素溶解。
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发表于 2014-6-8 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

绝对是不挂柱,ph7.8结合后蛋白很多都下来了,不过我确实是直接用8M UREA直接裂解菌体,没用其他非变性液,而且是不是超声时间也不太够
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-6-8 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真是金鱼良言那，谢谢，明天我就试试，希望可以，太感谢了。。。。
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发表于 2014-6-8 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那纯化需要那些试剂呢,步骤是什么呢?愿闻其详
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发表于 2014-6-8 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近,我用pET-32a载体表达25KD的蛋白,载体本身20KD,经鉴定目的蛋白存在于包涵体中,在纯化过程中,先用pH为8.0的8M尿素,0.1MNaH2PO4,0.01MTris-cl超声破碎15min,本以为再用pH梯度将目的蛋白最后洗脱下来,可是发现目的蛋白基本没有挂柱,而又用抗HIS的一抗做WB发现也没有问题,但就是目的蛋白不与镍柱结合,镍柱为Novagen公司,柱子本身应该没有问题,可问题出在哪一步,敬请各位高手指点迷津,急切盼望中.....

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首先看一下你的上柱前是否有蛋白，我觉得你的超声强度不够，而且你没有一个溶解包含体的过程，可能蛋白没有完全变成可溶性的。还有你要仔细阅读柱子里面的说明书，严格按照说明书操作。
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ladyhuahua[使用道具]
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 小中大
收到,我还是个新手,许多问题不是很明白,但具我所之咪唑浓度梯度不是洗脱可溶性蛋白的吗?我用尿素挂柱后,洗脱杂蛋白还用咪唑吗,您的意思是建议我我不用PH梯度是吗,那尿素和咪唑混用不相互影响吗,十分感谢!!!!!!!!!!!问题是不是太多了,呵呵

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咪唑可以洗脱可溶性蛋白。我也不建议使用PH梯度洗。尿素和咪唑没有什么影响，反正你纯化之后还要复性的，而复性多数是使用透析复性，那样绝大多数的尿素和咪唑都会被去除。
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-6-8 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是只要把urea换成盐酸胍就可以了,其与不变,急

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如果仔细检查后尿素溶解还是不挂柱的话，那就用盐酸胍试试吧。
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