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标题:【求助】蛋白不表达

okhaha[使用道具]
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【求助】蛋白不表达

我用的是pET-21a载体插入了1100bp的目的基因,转入BL21(DE3)中,测序后中间出现了三个点突变,不是终止密码,其他都 正确并没有移码。但始终不表达,IPTG浓度、温度及诱导时间都摸过了,仍看不到目的条带。毕业在即,请高手指教,我现在想转化到与pET-21a载体配套的其它宿主菌中看看能否表达,但实验室中只有BL21(DE3),希望有其他宿主菌的好心人分我一点,谢谢。
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hold住[使用道具]
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建议用rosetta,因为肯能你的蛋白序列中存在稀有密码子、
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okhaha[使用道具]
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我也想试试rosetta,但是实验室没有,希望有这个菌的战友能分我一点。
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okhaha[使用道具]
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会不会是我的目的蛋白有毒性,我听说如果表达的目的蛋白有毒性,可在LB培养基中加入0.5-1%的葡萄糖,那是什么时候用这种加了葡萄糖的培养基呢?是不是一开始从甘油管中接种摇过夜就用,还是第二天转接时用呢?这种加了糖的培养基在115度20分钟灭菌行吗?
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PINK[使用道具]
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葡萄糖炭化温度是121度,115度20分钟灭菌没有问题。有个问题想请教,在LB培养基中加0.5%-1%的葡萄糖有相关文献吗?
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okhaha[使用道具]
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我也是在论坛上看到的,Novagen pET原核表达手册上也有说过。我还没有查过相关文献。
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H2O[使用道具]
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葡萄糖炭化温度是121度,115度20分钟灭菌没有问题。有个问题想请教,在LB培养基中加0.5%-1%的葡萄糖有相关文献吗?

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加入glucose主要是针对乳糖操纵子控制的PET系统在BL21(DE3),BL21(DE3)plyss,BL21(DE3)plyss star等菌种的表达,防止在诱导之前本底表达影响了菌体的生长,因为培养基中不可避免的有乳糖的污染,加入glucose后菌体首先利用glucose不会收到乳糖的诱导。BL21(DE3)plyss,BL21(DE3)plyss star是比BL21(DE3)控制更严紧的菌体,因此对于有毒的蛋白前者更有优势。
glucose的消毒可以通过过滤的方式,也可以按楼上站友的方法高压。
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okhaha[使用道具]
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我的宿主菌是BL21(DE3),我试了一下用1%的葡萄糖结果蛋白还是没有表达,呜呜.....
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yonger[使用道具]
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请问你表达的蛋白要制备抗体吗?
建议你把这个基因分段表达!
我就试过!
全长不能表达出来,然后去掉几个氨基酸就能表达出来!
原因在蛋白对表达菌具有很强的毒性!
还有,你可以把这个片断重新克隆一下,尽可能没有突变。
1110bp不算太大哦!
希望对你有些帮助
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okhaha[使用道具]
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谢谢楼上的建议,我想试试转化到BL21(DE3)pLysS中表达,据说它比较适合有毒性的蛋白表达。另外我们老师打算让别的实验室帮忙重新换一个载体及宿主菌,试试能否表达。
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