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标题:【求助】第一次跑的2D

fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】第一次跑的2D

有成片的条纹，不知是不是蛋白？怎么造成的？
附：缺角端为酸性端，PH3－10。
样品是放线菌的蛋白。
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66+77[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.第一个给我的感觉就是上样量太大了，应该减少，用紫外分光光度计，吸光度在70左右就好
2.可能你的样品前处理没有很好的将核酸类的除去，请用Dnase 1和Rnase 1除去
3.没有很好的除盐，可用TCA-丙酮沉淀加低温冻，或者买专门的除盐试剂盒，BIO-RED或安玛西亚的都可以
4.蛋白堆在一起，说明IEF不是很好，考虑一下样品的前处理，如果需要相关的文献，请站内联系
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chenshuanhe[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢答复！
1 吸光度在70，我是新手，不好意思，不太明白。当时上样量是70微克。
2 IEF的电泳参数是200v 15min，300v 30min，400v 1h。是否有需要改进的地方？
3 我的样品确实没有经过处理，如果你能提供相关的资料，真的是非常感谢！
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3N4G[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的IEF电泳参数是不是写错了?如果真得是你所写的那样,那一向的聚集肯定是不够的.看你的电泳结果有很多的横纹,这也表明一向的聚集不够.我用BIO-RAD的仪器,7CM的小胶条一般用以下的聚焦程序:
50-60V 12-16h
250V 30min
500V 30min
4000v 3h
4000V 20,000VHT
当然,这可能只是其中的原因之一,蛋白样品的前处理也是十分重要的.双向的蛋白样品要求十分高,要无糖,无核酸,盐浓度低等等.
以上建议希望对你有帮助.祝成功!
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 3N4G 于 2014-6-8 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你的IEF电泳参数是不是写错了?如果真得是你所写的那样,那一向的聚集肯定是不够的.看你的电泳结果有很多的横纹,这也表明一向的聚集不够.我用BIO-RAD的仪器,7CM的小胶条一般用以下的聚焦程序:
50-60V 12-16h
250V 30mi ...

谢谢你的建议！
你使用的应该是IPG胶条吧，我用的是自制IEF凝胶，先是进行了预电泳，才参照所列的参数进行一向电泳。第一次跑的参数都是参考别人的，自己还没摸索，应该还有待改进的地方。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以考虑一下考染，就没有银染这么敏感，点应该不会这么堆积
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ffaa[使用道具]
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发表于 2014-6-8 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.第一个给我的感觉就是上样量太大了，应该减少，用紫外分光光度计，吸光度在70左右就好
2.可能你的样品前处理没有很好的将核酸类的除去，请用Dnase 1和Rnase 1除去
3.没有很好的除盐，可用TCA-丙酮沉淀加低温冻，或者买专门的除盐试剂盒，BIO-RED或安玛西亚的都可以
4.蛋白堆在一起，说明IEF不是很好，考虑一下样品的前处理，如果需要相关的文献，请站内联系
......

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你好，能否给我提供样品处理和聚焦方面的文献，非常感谢。
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