蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】做了多次包涵体复性,总是出问题!

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】做了多次包涵体复性,总是出问题!

S6044[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75117
精华 0
积分 559
帖子 797
信誉分 100
可用分 4821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
1
 

【求助】做了多次包涵体复性,总是出问题!

我做的蛋白有6个二硫键结构,在原核表达中表达占70%以上,但是以包涵体形式存在。
用6M尿素溶解后,蛋白含量很高约为4mg/ml,在做稀释复性时为了达到透析的要求,要将蛋白稀释为0.1mg/ml,因此,我取2.3ml蛋白将它稀释为100ml。可是问题就出在这里了,很缓慢,很缓慢的向蛋白中加入PB(含有谷光苷肽和PEG),蛋白很快就析出来了。
我觉得可能是蛋白浓度太高,就试着用含6M尿素的PB将这2.3ml的蛋白稀释为10ml,再用PB稀释十倍,同样,蛋白也很快析出。
查文献后,有人用Tris做过,我也换成Tris,可是同样的问题也出现在稀释时。
我还试着用含4M尿素的PB稀释蛋白后直接透析,4个小时不到,透析袋中明显变白了!!!
哪位大虾知道这是不是我的蛋白很容易沉淀?难道所谓的复性蛋白损失量很大就是这么损失的?我该怎么办,都做了2个月了!愁死我了!
顶部
loli[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 71788
精华 0
积分 736
帖子 1171
信誉分 100
可用分 6650
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-31
状态 离线
2
 

我建议你用恒流泵往里加稀释液,调整好流速,边加边搅拌。
我用过这个方法,效果还是不错的。稀释好后再进行透析。
这个方法是我自己想出来的,开始师姐做的时候用的是分步稀释法,效果不是很好,总是出现絮状沉淀,而且费时,现在问题都得到解决了。
对了,我的复性液是0.1Mtris-HCl(pH8.8)含10-6硫酸铜。
我不知道你为什么要选择透析,用超滤不是更好吗?省时省力
顶部
S6044[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75117
精华 0
积分 559
帖子 797
信誉分 100
可用分 4821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3
 
你们用恒流泵时流速是多少呢?我也是边加边搅拌的,可能速度快了些,大概一分钟1.5ml的稀释液。
硫酸铜在复性液中作用是什么?
稀释好后,在4度放48小时让蛋白复性,然后透析,你们也是这么做的么?
我订了密理博的超滤离心管,一次性的,每个可处理15ml。如果用超滤管成本就比较高了,我身边同学都用的透析方法,请问,你们用的超滤也是直接买的超滤管么?
顶部
zhenxin[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76024
精华 0
积分 748
帖子 1216
信誉分 100
可用分 6848
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-31
状态 离线
4
 

首先。我觉得稀释复性是应该将蛋白溶液缓慢加到复性液中,而不是你说的复性液加到蛋白中。前者的好处是一直维持复性液中的蛋白浓度很低,最后才达到终浓度。后者蛋白浓度一直都很高,最后才达到最低浓度。当然前者好了。
其次。你稀释复性蛋白的浓度有点高,一般是0.01~0.1mg/ml的浓度。你这个浓度适合透析复性。
再次。用含4M尿素的PB稀释蛋白后不能直接对没有尿素的复性液进行透析。应该逐渐降低尿素的浓度。如先2M ,再1M 等等。而且你这样做更像是透析复性了!
顶部
S6044[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75117
精华 0
积分 559
帖子 797
信誉分 100
可用分 4821
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
5
 
如果向大体积的稀释液中加入蛋白,那么蛋白马上就析出来了,我第一开始就是这么做的。
顶部
ladyhuahua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76658
精华 0
积分 984
帖子 1667
信誉分 100
可用分 9116
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-8
状态 离线
6
 
首先。我觉得稀释复性是应该将蛋白溶液缓慢加到复性液中,而不是你说的复性液加到蛋白中。前者的好处是一直维持复性液中的蛋白浓度很低,最后才达到终浓度。后者蛋白浓度一直都很高,最后才达到最低浓度。当然前者好了。
其次。你稀释复性蛋白的浓度有点高,一般是0.01~0.1mg/ml的浓度。你这个浓度适合透析复性。
再次。用含4M尿素的PB稀释蛋白后不能直接对没有尿素的复性液进行透析。应该逐渐降低尿素的浓度。如先2M ,再1M 等等。而且你这样做更像是透析复性了!
......

=============================================================================================================

我想冒昧的更正战友一点,稀释复性一般是将蛋白溶液缓慢加到复性液中的没错,但是也可以倒过来。请见谅,我们应该对他们负责。不好意思。
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
7
 


QUOTE:
原帖由 ladyhuahua 于 2014-6-8 18:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先。我觉得稀释复性是应该将蛋白溶液缓慢加到复性液中,而不是你说的复性液加到蛋白中。前者的好处是一直维持复性液中的蛋白浓度很低,最后才达到终浓度。后者蛋白浓度一直都很高,最后才达到最低浓度。当然前者好了。
...

这位战友说得没有错。是可以到过来。但只是觉得没有前者好,这点我已经在上次帖子中说了。
向蛋白中加入稀释液我觉得有以下问题:以楼主蛋白为例,当加入稀释液使尿素终浓度为4M时,这时蛋白浓度还有2.7mg/ml,而此时大部分蛋白已经开始复性了。即使稀释到大部分蛋白复性结束(2M尿素)蛋白浓度还有1.3mg/ml左右,这样蛋白当然容易沉淀了。
还有就是如楼上战友所说的边加要慢慢搅拌才行。要不局部浓度过高也会沉淀的。
如果还不行。可以考虑换buffer,加入其它促折叠的因子。如arginine,glycerol,glycine等。或者是复性的温度也是一个考虑因素。
最后,你可以检测一下到底复性液中有没有你的复性蛋白。说不定还有些呢。计算一下有多少可溶啊!呵呵。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
8
 


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2014-6-8 18:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


这位战友说得没有错。是可以到过来。但只是觉得没有前者好,这点我已经在上次帖子中说了。
向蛋白中加入稀释液我觉得有以下问题:以楼主蛋白为例,当加入稀释液使尿素终浓度为4M时,这时蛋白浓度还有2.7mg/ml,而此时大部分 ...

不能同意你的观点,这位战友对稀释复性两种方法的比较过于片面。
每一种复性方法都有其自身的特点,正所谓存在自有道理。
这位战友所说的稀释复性时向稀释液中加入蛋白的方法的优点我也很赞同,确实在整个过程中都能保持蛋白的低浓度,有利于蛋白复性。但有一点不要忘了,在这种方法下,变性剂是在瞬间被稀释到低浓度的,也就是说在极短的时间内,我们的蛋白就完成了主体构象的折叠,它是一个瞬时的过程。
并不是所有的蛋白都适合以这种方法折叠复性的。正因为这个问题的存在才有了将稀释液向蛋白溶液中加入的反其道而行之的方法,在这种情况下变形剂的浓度是逐渐的缓慢的被稀释的。这种方式类似与透析,使的蛋白有机会经历各种构象并正确折叠。至于你说的起始蛋白浓度过高,很容易沉淀。我觉得这不是问题,就拿楼主的蛋白来说,干吗要4mg呢,0.4mg就不行。毕竟稀释复兴蛋白终浓度从0.01mg 到0.1mg 都是正常的。
顶部
箭头儿[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74102
精华 2
积分 452
帖子 536
信誉分 104
可用分 3456
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
9
 


QUOTE:
原帖由 ukonptp 于 2014-6-8 18:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


不能同意你的观点,这位战友对稀释复性两种方法的比较过于片面。
每一种复性方法都有其自身的特点,正所谓存在自有道理。
这位战友所说的稀释复性时向稀释液中加入蛋白的方法的优点我也很赞同,确实在整个过程中都能保持 ...

呵呵。看来uk战友对复性有较深研究。不过我想说一点我自己的拙见:1、瞬时尿素浓度降到最低我觉得并不是说马上就完成折叠的过程,还是需要时间过度到复性中间体并最终复性成功的,所以还需要继续放置一段时间让他缓慢折叠。2、我觉得复性过程最重要的是防止复性蛋白中间体的聚集作用(通过蛋白之间的疏水补丁等相互聚集),这关系到复性成功及复性率的大小。
3、假入按照您说的把蛋白浓度调到0.4mg/ml(或者4mg/ml)并用不含尿素的复性液稀释到0.1mg/ml,然后再放置复性的话,您觉得从0.4mg/ml(4mg/ml)稀释到0.1mg/ml这段时间里面(尿素浓度很低)蛋白就已经复性了吗?还有就是您这样做还不如直接用8M尿素将蛋白稀释到0.1mg/ml再去透析复性,那样尿素浓度变化不是更缓慢?比直接用复性液加到蛋白中尿素浓度变化应该是更缓慢一些!
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
10
 

A.同意箭头儿战友说的1。中 “瞬时尿素浓度降到最低我觉得并不是说马上就完成折叠的过程”,但此时不是“需要时间过度到复性中间体并最终复性成功的”,而是已经过渡到复性中间体,并且是复性后期中间体,所以我才会说是:“蛋白主体构象折叠的完成”, 当然这以后还需要继续放置一段时间让他缓慢折叠。
B.同意你的2。但实际上还是可以加点别的更加全面一点。
C. 我跟你讨论的是稀释复性时两种方法的比较问题(我的意见是不能肯定哪种方法更好,存在既有道理,不同的蛋白适合不同的方法,多一种方法总是多一条路)。至于您说的从0.4mg到0.1mg蛋白有没有复性好,那我就不得而知,具体的东西只有作了才知道,不是吗?至于您说的那还不如去作透析呢,是啊,也可以,我没有说不可以啊。我只是对稀释复性中两种不同的方法阐述我的意见。另透析复性其实只能在实验室作作,很难线性放大并规模生产。这一点对我们这种需要有点产出的行业来讲是很忌讳的。
以上纯属个人愚见,对于蛋白复性这块我所知有限,目前行业中流行的有透析、稀释和超滤复性法及最时髦的柱上复性。对于超滤复性法本人所知有限,一般都用于大规模生产,可惜我这个和尚太小,没有机会去个大庙见识一下如何如何。其他几个在实验室都是常作的,条件也都允许。所以经常也会有这样那样的顾虑,到底哪个方法更好,更实用呢?后来有机会结识了一位AMERSHAM的复性高手,交流之后还是达到了几点共识,实验室或者基因工程药厂作复性不管是研发还是生产,稀释复性还是最有效的。柱上复性自个儿玩玩还可以,要上生产太难,毕竟技术没有那么成熟(当然国内也有成功的范例。)
再次重申一下,以上纯属个人愚见,仅供参考。
蛋白复性仁者见仁,智者见智。
箭头儿:
战友如果有什么意见理念不同,可以回帖,
不过我将会保留自己的意见,这个贴子就到此为止,从我始自我终。
理念上的东西,难说,
实验作出来了比什么都强。有冒犯的地方,要见谅了,呵呵。
顶部