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　　键合固定相的基本原理

　　键合固定相的基本原理Ⅰ

　　碳量及键合度

　　测试方法和量度

　　填料含碳量用元素分析来测量。通常，所得结果直接用来表示填料的碳量。用这个值，结合填料比表面积的知识以及键合的配基的分子量，键合度就可以计算出来。键合度通常用μmol/m(2)(微摩尔每平方米)作单位。键合度有时候也叫做表面覆盖率。键合度是键合相表面组成的一个非常重要的量，也是决定填料的选择性的一个重要的参数。

　　碳量

　　在相同的硅胶基质上，相同的键合度，配基分子量越大，碳量越大;因此，C18固定相比C1固定相有更高碳量。相同配基，相同硅胶;覆盖率越高，碳量越大。对于相同配基，相同的表面覆盖率;填料的碳量随孔径的增加而减少，应为比表面积下降了。基于这点，我们可看到，只用碳量是不能衡量填料的选择性和保留性能的。

　　键合度

　　键合度，又称表面覆盖率，是一个更好的表示填料特征性质的方法。可以用下面的公式计算：

　　x=%C/(100*SA*(1-%C*(MW-1)/(100*nC*12)))

　　SA是比表面积，%C是碳量，MW是配基的分子量，nC是配基分子中碳原子的数目。

　　这个值越高，填料表面柱配基的密度越高。它也是表示表面硅醇基密度减少的方法。在完全羟基化的硅胶，硅醇基的表面密度约为8μmol/平方米。对键合单功能基配基的不同键合相，主配基的键合密度在0.5到4μmol/平方米之间。键合密度的再生对于填料保留性质和选择性质的再生是最重要的。此外，高键合密度的填料对于水解的稳定性比低键合密度的填料好。

　　按键合密度分组的C18填料

　　低密度 中等密度 高密度

　　键合相类型和封端

　　键合相是用有机硅烷与硅胶表面进行化学反应而产生的。目的是获得均匀的单分子层。在键合反应中可使用不同的硅烷。硅烷可分为单功能基、双功能基和三功能基的，根据与硅胶表面键合的硅烷的基团数目来分。对于单功能基的硅烷，由于空间位阻的原因，键合密度不会超过4微摩尔/平方米。而多功能基的硅烷可以获得更高的键合密度。通常，这种高键合密度的填料被称为多聚物填料，尽管并不怎么可能形成聚合物。反之，低键合密度的填料被称为单聚物填料。填料的选择性决定于键合的密度。尤其是在分离碳水化合物时，不同键合密度表现出不同的选择性。多数能得到的商品键合柱键合密度低于4微摩尔/平方米，也就是属于单功能基的。

　　单功能基的键合覆盖率更容易预测，因为不会有第二功能基产生复杂的副反应。但是，硅胶表面键合单功能基硅烷比键合多功能基的更容易水解。

　　三功能基硅烷于硅胶表面的键合，更难重现。折衷一下，键合二功能基，使得更耐水解。三功能基硅烷键合相更适用于低pH流动相。

　　生产商并不都公开它们的键合技术。但多数会指出是否是单功能基C18。现在多数推荐这种填料，因为用单功能基硅胶可以得到高的重现性。

　　对于在高或低pH，易于水解的流动相中，最好使用耐用的多功能基键合硅胶。所有硅胶基质的离子交换填料都是三功能基的。如果腈基填料用于反相色谱，用硅胶基质耐用(低孔体积)、三功能基硅烷的较好。一些生产商会生产专门用于反相色谱的腈基键合相。

　　单功能基配基的 三功能基配基的

　　Symmetry C18 Waters Spherisob ODS2

　　Nova-Pak C18 Waters Spherisob CN

　　μBondapak C18

　　封端

　　对于许多反相填料，要进行二次键合以覆盖硅胶表面未被反应的硅醇基。通常使用小分子硅烷，如三甲基氯基硅烷(TMCS),以便获得最大的覆盖率。这个步骤称为封端。在反相色谱中，封端用于多数的键合相;用在正相或其他色谱的键合相不用封端。没有封端的反相色谱填料通常比封端的有更多样的选择性。但是，碱性物质在不封端的填料上，容易产生拖尾。三甲基硅烷基(封端基团)在酸性条件下容易水解。因此，封端的填料不能pH<2的条件下使用。

　　译自Waters Chromatography Columns and Supplies Catalog 1999-2000