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标题:【求助】蛋白表达不正确

lixi559[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白表达不正确

大家好，最近构建表达鱼生长激素，克隆到pET-22b（＋）中转化大肠bl21，基因测序正确，IPTG诱导后出现特异性带，理论分子量是23kd，但是sds－page和质谱分析都是29kd，怀疑不是我要的目的蛋白。基因测序正确啊，并且不经IPTG诱导就没有特异表达，这不是我的蛋白又会是甚么呢，请各位指点迷津。29kd处特异表达有老师怀疑是B-内酰胺酶，但是它会严格受IPTG诱导吗？
下面不知道怎么做了，因为蛋白的其他的性质不是很清楚，并且其活性只能通过喂鱼才能体现，周期很长。现在想把它酶切成小肽段后质谱分析序列，但是我不懂质谱，请问各位用甚么酶切啊，是特异性的还是通用的胰蛋白酶甚么的，怎样选择呢？请高人指点。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.进一步做Westren blot鉴定
2.如果基因测序正确，分子量只能参考。因为理论分子量与实际分子量本来就不同，况且在表达过程中可能有的氨基酸发生酰胺化。
3.进一步做活性研究。
仅供参考
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是做weatern没有抗体啊
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那就先检测一下 是否有β-内酰胺酶 活性啊？
如果没有，不就可以排除这个可能了？
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am10[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
实验出现问题,比较着急,大家都可以理解,但也请ssj123不要重复发帖求助,另外,请修改标题格式.
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以先做2 个分别在C端和N 端带有6*HIS 的载体,然后表达,做WERSTERN
不就知道了吗?
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道楼主用的是什么酶切位点，不过我觉得用pET-22b质粒表达出现这种现象应该是比较正常的。因为pET-22b质粒本身带有pelB信号肽，如果再考虑加上两端各种酶切位点的序列，表达目的蛋白时分子量应该会增加约4-5KD；因为我在表达我的目的蛋白时就出现过这种现象。当然，楼主也可以用带有HIS Tag的抗体进行检测。至于楼主打算用质谱进行序列分析的话，可以用胰酶进行消化后进行！仅供参考！祝你好运！
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的建议，做WERSTERN需要抗体，有现成的his抗体吗，上面有位朋友说做2 个分别在C端和N 端带有6*HIS 的载体,是什么意思啊？ 我没有做过western，不太明白。
另外有位朋友说是信号肽的问题，我的酶切位点是xba I和xho I，xho I后面连接his标签，pet上的pel已经被切割掉，不应该有信号肽的问题了吧，急等指点。
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33号[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以用质谱做一个MS－MS，搜库可以知道蛋白序列，就可以确定了吧！
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