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标题:【求助】SDS-PAGE显示有目的条带，但WB总是没有结果...

bling[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE显示有目的条带，但WB总是没有结果...


最近作蛋白表达，蛋白大约90KD，带有His标签。每次跑胶条带很清晰，显示有目的条带大小的片段，可作了两次WB，曝光后胶片上都没有任何东西，不知道原因何在？很是着急，请园子里的高手给分析一下，谢谢！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

检验一下转膜有没有问题 ，在适当的电压下，转膜时间不能太短，也不能太长
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bling[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的，我转完膜后作过丽春红染色，能够看到条带的。
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发表于 2014-6-9 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转完膜后作过丽春红染色，能够看到条带,只能说明蛋白转到膜上,而WB有许多步骤,如果一抗有问题,或二抗有问题,甚至显色底物有问题,都会功亏一篑.总而言之,遇到任何实验不工作时,分析原因要按每一步操作来分析,不能只是盯在一点上.不要轻易下结论.
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在就是在分析原因实验失败的原因，我的一抗是刚刚从novagen公司购买的，应该没有什么问题。只是蛋白样品是酵母上清中的（用摇瓶作少量表达），没有经过纯化，因为我担心WB检测不到His标签的话，纯化的时候能挂到柱子上吗？
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你怎么知道你认定的90kd条带就是你要的目的蛋白？你怎么知道它就不是酵母自身表达的蛋白？酵母的优势表达会如此明显吗？有阴性对照吗？
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发表于 2014-6-9 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的问题多多,首先你犯了实验的大忌:没有阳性对照!你怎么知道novagen的抗体没问题?如果你在旁边走一个其他的HIS融合蛋白,就会很清楚了.第二,你根据分子量断定90kd条带就是你要的目的蛋白,正如tiger22(虎娃22)所说你怎么知道它就不是酵母自身表达的蛋白.另外,没有全面分析失败的原因,比如二抗.一般来讲,His抗体有多抗,也有单抗.如果是多抗,二抗就用羊抗兔,如果是单抗,二抗则用羊抗鼠. 最后一点,你不知道酵母表达的效率是多少,用摇瓶作少量表达，没有经过纯化, 能检测到你的蛋白吗?
有几多的痛苦,就会有几多的收获!
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发表于 2014-6-9 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
向楼上的两位表示诚挚的感谢！因为我是一个新手，经过大家一讨论分析，我觉得自己的实验的确存在好多的问题，我现在正准备补加对照组的实验。
另外我的一抗是小鼠的单抗，二抗用的是HRP标记的羊抗鼠IgG(L+H),应该没有什么问题吧？
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发表于 2014-6-9 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的意思是:你在做WB之前,首先要算一下你的表达系统的效率是多少,你一共用了多少培养液,就可以估计有多少融合蛋白,电泳时又加了多少,总可以知道大约有HOW MUCH PROTEIN ON THE MEMBRANE.太少了WB无法检测.
GOOD LUCK!
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