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标题:【求助】SDS page 不出条带

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS page 不出条带


各位高手好，我最近作WB要测目的蛋白分子量为17KD。刚开始练习跑SDS page 的时候，用12％的分离胶、电压180V、跑70分钟蛋白Marker跑出四条带，改用15％的分离胶后Marker 跑出六条带，.样品的条带也很好。最近准备加抗体转膜，但是却怎么也不出条带。有时胶上1/4有较浅的条带，但到下面就什么也没有了；有时所有的条带都在上1/3，下面没有，时间也很长超过100分钟。30％的AA母液,1.5Mtris，1.0的tris，10％的APS,TEMED都是新配的，电泳液也是新配的，电泳仪也换了就是不出条带，快2周了，我都快急死了。实验室的其他人也跑不出来，不知是什么回事，请高手指点一二，不甚感激！
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先你的样品会不会有问题呢?
我跑10-116KD的蛋白均用10%的分离胶，都可以的，只要看着溴酚蓝还在胶里面，没跑出去就可以，为了保险，我一般都是跑到溴酚蓝离下边缘还有0.5cm的时候停止电泳。
你跑17KD的蛋白，完全可以用10%，12%的来跑，当然15%应该也没问题。
你用12%、15%跑胶marker条带不一样，我觉的不一定是胶不一样导致的。
你的积层胶呢是什么样的，我一般是0.5%的胶，上样孔下端到分离胶有0.5-1cm的距离。
跑电泳时候，分离胶部分我用70-80V的电压，积层胶我用120来跑，我不喜欢用高电压来跑，感觉这样发热多，会导致药品扩散。
你所说的 “却怎么也不出条带” 是最后发光压片没出条带？还是你就根据marker在胶上看？如果是前者，可能是你转膜及转膜之后的操作、试剂发生了问题。比如说你转膜的三明治没做好，转膜的电压太高，没有冰盒散热导致条带弥散，以及之后你的一抗、二抗有问题。
如果是根据marker在胶上看，那我觉的你应该坚持做到最后显影、压片再说。
祝你好运。
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电泳缓冲液检查一下,看看该加的都加了没有,有时候说不定遗漏了自己又没有发觉的哦!
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abc816[使用道具]
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发表于 2014-6-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉应该是你的配胶药剂可能出现了问题，解决的办法是把药品重新配制一下。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位高手的指点。我拿师姐的样品跑还是那样，我也觉得配胶的试剂可能有问题，打算把配胶的试剂重新配，再跑一下看看。谢谢各位。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

郁闷死了。还是没有条带，配胶的试剂都换了， 电泳缓冲液也是新配的。同学前天跑得稍好点，但是到了下部分条带模糊，且变弯了；昨天又不行了。（她用5％的浓缩胶，10％的分离胶。我用5％的浓缩胶，15％的分离胶。配胶的试剂都一样。）感觉样本在进入分离胶的时候显得很宽，压缩不成一条线，到了分离胶的时候条带越跑越宽，托尾特明显。到了底下就几乎看不见样品了。染色脱色后什么条带也没有。不知是什么原因？请高手指点指点吧，先谢谢了。
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 小中大

是不是样品不进胶阿？建议吧浓缩胶也一块儿染染，看看是不是样品还在分离胶和浓缩胶的分界处
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JK.jon[使用道具]
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 小中大
试试看。如果真是你所说的那样，说明什么问题，该怎样解决？
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lixi559[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主没表达好.她指的没条带不是暴光后片子上没条带.
而是胶上的条带不尽人意,是吧?Smile
17KD用15%的胶,差不多了.用12.5%也可以.
你说的"条带越跑越宽,拖尾明显,""有时胶上1/4有较浅的条带,有时所有的条带都在上1/3，下面没有，"应该如二楼所说,主要还是样品的问题.
是不是盐浓度太高,或样品浓度太高太粘跑不动,或是LOADING BUFFER配置有问题.
还有,个人觉得你跑胶的电压180V是不是太高了?!电压太高,有时候,溴芬兰跑出去了,样品还下的不太来.
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ritou1985[使用道具]
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 小中大
会不会是电压不稳的问题？
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