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标题:【求助】Western blot

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】Western blot


我的实验是分子量为75KD的蛋白，用半干恒压砖膜法（电压是15V），用了一个小时，但是里春红染色没有显影（一个点都没有），实验结果也是没有显影。是什么原因啊？真郁闷！求各位大侠给予指点！！
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先看看是不是自己操作的问题，设备是不是装的对不对。
然后检查一下电泳缓冲液。
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yychen[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉转膜的时间和电压都不够，估计是没转过去
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发表于 2014-6-9 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丽春红染不出来可能是转膜没有成功吧。你用什么转印仪器？我们实验室用的是Bio-rad的半干转印仪，常规都是用25v恒压转印30 min，75kd没有问题。
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室用的也是 Bio-rad的半干转印仪，我想问一问：转膜时间和膜的大小有没有关系？
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remenb[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该和膜的大小没关系，和蛋白的量以及大小有关
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发表于 2014-6-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了同样的问题,电泳后,考染时,蛋白挺好的,但是丽春红染了只能看出泳道的形状,不能成条带,只有小分子蛋白成条带,显影后结果也不行,请教各位,我该如何改下条件呢?
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发表于 2014-6-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果小分子量蛋白成条带而大分子量的蛋白没有条带，那就说明转膜的时间过短或是电压过小，如楼主为例，110KD的蛋白， 只转一个小时，很有可能是还没有转到膜上，可以增长时间试试。
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发表于 2014-6-9 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢了,上批的实验出条带了,但背景有些深,抗体浓度是按说明书走的,曝光时间选了30SEC和1MIN,还是深,今天把抗体浓度调低了,还不知道结果呢,您能给些建议吗?
谢谢了先!
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景深，可以先降低二抗的浓度试试看。TBST10 min 4 times or 3 times.
祝你好运！
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