蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】SOS---磷酸化蛋白质组课题设计

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】SOS---磷酸化蛋白质组课题设计

vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
1

发表于 2014-6-9 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SOS---磷酸化蛋白质组课题设计


磷酸化蛋白质组－－研究设计，恳请高手赐教！！！
实验目的：
想用蛋白质组学方法初步锁定某受体(AR)酪氨酸激酶活化激活的磷酸化蛋白质组，以此为基础进行后续研究，不知采用下面路线是否行得通？
背景说明：
(1)该受体信号转导途径：配体(A)→受体(AR)→AR耦联酪氨酸激酶活化→其他蛋白质被磷酸化(即A依赖的磷酸化蛋白质组)；
(2)上述信号途径参与细胞主要功能是已知的，但不知A可以诱导哪些蛋白质磷酸化(磷酸化蛋白质组)？
(3)文献表明，这些所谓“A依赖的磷酸化蛋白质组”，很可能促进或抑制了B信号系统的功能。
(4)因此，如果用磷酸化蛋白质组学技术，首先初步锁定“A依赖的磷酸化蛋白质组”，再通过文献或预实验从这些蛋白质组中筛选一个或两个与B信号系统相关的磷酸化蛋白，进行功能研究。试图证实A信号系统与B信号系统存在相互作用，并可能阐明作用机制。
(5)实验中本来就不打算将靶蛋白的磷酸化位点鉴定出来。
拟定路线：
(1)细胞处理：对照细胞不受A刺激，实验细胞A刺激;
(2)分别裂解细胞(低温环境＋蛋白激酶抑制剂);
(3)细胞裂解液分别行胰蛋白酶解(获得磷酸肽混合物);
(4)酶解的磷酸肽混合物分别经IMAC纯化，获得富积的磷酸肽;
(5)洗脱液(含富积的磷酸肽)分别进行LC-MS分析;
（6）查询蛋白质组学数据库,初步锁定"A依赖的磷酸化蛋白质组";
(7)比较接受和未接受A刺激的两个"磷酸化蛋白组"，找出差异蛋白;
（8）通过文献检索、评价，从差异蛋白中进一步筛选那些与B信号转导有关联的蛋白，作为后续研究的候选蛋白;
(9)候选蛋白的生物学功能验证，阐明A信号系统与B信号系统之间的关联。
目前问题：
(1)采用上述路线，是否能达到预期实验目的(从理论上讲是否合理)？
(2)如果上述路线不行，最好如何修改和制定技术路线，才更科学、更快捷、更经济？？
首先忠心感谢园友的帮助！！！
由于缺乏实战经验，肯请大家赐教！！！
顶部
flower-201[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74055
精华 0
积分 443
帖子 605
信誉分 100
可用分 3785
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
2

发表于 2014-6-9 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

觉得你的思路没问题，但是否应当注意一些细节性的问题，一下是我的建议，谨供参考：
1。应当事先确认细胞中的目的蛋白质在细胞刺激后是否被磷酸化。（可用磷酸化抗体作WB，或者用autoradiography可以确认。）
2。据我所知做MS所需的目的蛋白质的量比较大并且要求SDS-PAGE分离后的目的蛋白质有较高的纯度，否则会导致结果不准确。从细胞中是否能够得到足量并且高纯度的目的蛋白质也应该事先确认一下。（如果知道目的蛋白质的分子量，用SDS-PAGE分离后用CBB染色就可以判断。）
3。当然用落氨酸激酶抑制剂作阴性指控也是很必要的。
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
3

发表于 2014-6-9 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面还得请教几个问题：
一、我在这方面还没有实践经验，只是看了些相关的文献。因此，还有很多细节问题需要处理。希望能得到您的支持和帮助。
二、我准备做的受体在相应配体刺激下，肯定要活化，它是骆氨酸受体，但哪些蛋白被磷酸化并不知道。我的目的是想将它活化后激活的磷酸化蛋白质组筛选出来，然后根据它们与相关信号转导的关系，进行生物功能验证。
三、问题的关键是：如果按照上述基本路线，加上您所说的一些细节问题的处理，能不能达到实验目的？？
不好意思，又麻烦您了。
顶部
ukonptp[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 103464
精华 5
积分 796
帖子 992
信誉分 110
可用分 5846
专家分 50
阅读权限 255
注册 2013-1-11
状态 离线
4

发表于 2014-6-9 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有相关经验，看过一些文献。
有几个问题：
1、磷酸化蛋白质组的关键问题之一是磷酸化肽段富集，是否可以增加在蛋白质水平的磷酸化蛋白的富集？
2、您怎么知道鉴定到的蛋白质是活化后激活的？对照与样本是否需要某些标记？
顶部
3648755[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77481
精华 0
积分 574
帖子 767
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
5

发表于 2014-6-9 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 据我所知只是由上述方法来认证一种蛋白质，并确定磷酸化对其功能的影响就已经是一个要花费很大精力的实验了。如果你想同时鉴定数种磷酸化蛋白质，并对他们的功能进行解析的话，那可能将是一项庞大的工程。
2. 最好先在文献中查阅一下内容：
. 你所说的那种受体激活的骆氨酸激酶经常参与细胞中那些功能的调节，比如说胞吞，胞 饮。。。。。
. 哪些重要的蛋白质参与了这种功能。
. 是否有通过磷酸化来调节这些蛋白质功能的论文。
通过以上查询结果，你可以大致得出目的蛋白质的选择范围，并可通过那种蛋白质所 参与的细胞反应，来设计磷酸化之后对那种细胞功能的影响。
3。建议你先做一些前驱试验，确定在受体刺激之后上述2中你所查巡到的哪种蛋白质被磷酸化。从中选出一种到2种关键蛋白质进行进一步的分析（用受体的抑制剂或骆蛋白激酶抑制剂，在同样反应条件下，这种蛋白质不被磷酸化。）。如果你得到了很clear得结果，那你再考虑分离这种蛋白作MS.
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
6

发表于 2014-6-9 16:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其次，我还要做几点说明(可能我还没有把实验目的说清楚)：
(1)该受体信号转导途径：配体(A)→受体(AR)→AR耦联酪氨酸激酶活化→其他蛋白质被磷酸化(即A依赖的磷酸化蛋白质组)；
(2)上述信号途径参与细胞主要功能是已知的，但不知A可以诱导哪些蛋白质磷酸化(磷酸化蛋白质组)？
(3)文献表明，这些所谓“A依赖的磷酸化蛋白质组”，很可能促进或抑制了B信号系统的功能。
(4)因此，如果用磷酸化蛋白质组学技术，首先初步锁定“A依赖的磷酸化蛋白质组”，再通过文献或预实验从这些蛋白质组中筛选一个或两个与B信号系统相关的磷酸化蛋白，进行功能研究。试图证实A信号系统与B信号系统存在相互作用，并可能阐明作用机制。
(5)实验中本来就不打算将靶蛋白的磷酸化位点鉴定出来。
最后，如果按照这样的设计路线，是否能达到实验目的？
(1)细胞处理：对照细胞不受A刺激，实验细胞A刺激;
(2)分别裂解细胞(低温环境＋蛋白激酶抑制剂);
(3)细胞裂解液分别行胰蛋白酶解(获得磷酸肽混合物);
(4)酶解的磷酸肽混合物分别经IMAC纯化，获得富积的磷酸肽;
(5)洗脱液(含富积的磷酸肽)分别进行LC-MS分析;
（6）查询蛋白质组学数据库,初步锁定"A依赖的磷酸化蛋白质组";
(7)比较接受和未接受A刺激的两个"磷酸化蛋白组"，找出差异蛋白;
（8）通过文献检索、评价，从差异蛋白中进一步筛选那些与B信号转导有关联的蛋白，作为后续研究的候选蛋白;
(9)候选蛋白的生物学功能验证，阐明A信号系统与B信号系统之间的关联。
希望能再次得到答复！！！！
由于是课题设计，自己又缺乏蛋白质组学实验经历，迫切需要园友的帮助，谢谢！！！！
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
7

发表于 2014-6-9 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得你的实验设计是有问题的,我的建议:
1,有人已经提过,你怎么知道哪些蛋白质是激活产生的呢?你需要做标记,即做定量蛋白组,实验细胞进行稳定同位素标记,而对照组不标记,这样可以分析出刺激后表达提高的蛋白质,即激活蛋白;
2,你有必要先做用姥氨酸蛋白抗体做IP富集磷酸化蛋白,这样你可以不需要再IMAC富集磷酸化肽.
3,最好你知道刺激后有标志性的蛋白质会磷酸化,你可以做western检测你的细胞刺激模型是否建好.相当于质量控制啊;
4,你最好是把磷酸化位点给鉴定出来,要不谁相信你鉴定了磷酸化蛋白.
这个实验本身的技术的难度还是有的,作好思想准备.
有不对的地方请指出.
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
8

发表于 2014-6-9 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的试验思路是正确的，只是你想通过什么试验去检测那些是由于激活受体而导致磷酸化蛋白质？
据我所知，用我以前所说的那两种方法的任意一种可判断出磷酸化蛋白的分子量，以及在SDS-PAGE上的条带。
1。用磷酸化抗体做WB.
用能识别骆氨酸激酶在蛋白质上的磷酸化的抗体（我用过能识别S/P 和T/P 序列的磷酸化抗体）
多设计质控标本：
negative control: 加入受体阻断剂的细胞，加入骆氨酸激酶抑制剂的细胞，未受刺激的 细胞.
2。用同位素标记。(autoradiography or liquid scintillation analysis)
因为磷酸化过程中需要ATP,因此在细胞培基中加入同位素r-P32 ATP，刺激后被磷酸化的蛋白质通过autoradiography可看到这种蛋白质在SDS-PAGE上的条带。
如果顺利的话，相信通过这两种方法会鉴定出磷酸化的蛋白质，然后你再作MALDI-MS.
顶部