【求助】GST融合蛋白原核表达及GST pull down的一系列问题

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标题:【求助】GST融合蛋白原核表达及GST pull down的一系列问题

she[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.加入IPTG诱导后，多长时间可收集菌体？
2.将菌液沉淀后，若一时没时间做菌体裂解、pull down的工作，可以将菌体沉淀4度保存吗？还是将其超声裂解后保存？
3.若细胞裂解液一时没准备好，结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose可以4度保存多久？如何保存？
谢谢！

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人新手，没有能力回答您的问题，但是想请教您，本人拟采用GST pull down 作蛋白质的相互作用。大致思路：已采用免疫共沉淀确定A与B存在相互作用，且获得了A＆B的真核表达质粒。现将A分为七个结构域，进一步确定A与B的互作域。请问1）将A及其截短的基因片断所表达的蛋白质作为bait蛋白还是将B作为bait蛋白合适？2）prey蛋白如何获得？请高手救急，多谢高手指点。

she[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1)将A的片段作为bait蛋白合适，因为，pull down 下来的产物需要用另一蛋白抗体做Western检测。B蛋白是有抗体的，A的七个片段能都有抗体吗？
2)Western检测；

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！prey蛋白通过什么方式获得最好？原核表达？真核表达？还是体外表达？

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

偷偷请问一下大概我完成这个实验需要多长时间？多少米？呵呵，不好意思。

windy+++[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.加入IPTG后一般5-6小时后蛋白质表达最佳。
2.将菌体沉淀后，在4度保存24左右应该没有问题，超过24小时最好保存在-80度，最好不要用超声波粉碎后再保存，在沉淀块的状态蛋白质更稳定。对与某些对蛋白酶敏感的蛋白质应该在做好沉淀块儿之后尽快往下做，否则会导致蛋白分解，收量减少。
3.结合后的GS Beads 可以在4度保存24-48小时左右，最好在你的binding buffer 中加入适量蛋白酶抑制剂，我用罗氏的complete - 种蛋白酶混合抑制剂，以减少蛋白分解。但同样不建议保存，任何方法都只能减少或延缓蛋白分解，却不能阻止蛋白质分解，因此尽快的完成整个实验是最好的选择。

she[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，我也刚开始做pull down