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标题:【求助】我的蛋白分子量较小，该如何选western的电流呢

eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】我的蛋白分子量较小，该如何选western的电流呢



FREE:
   我想用湿法来转膜作ｗｅｓｔｅｒｎ，我的蛋白只有１７KD我在园子里看了一下，关于转膜的电流众说纷纭，我想用用的是９０mA过夜，１０小时．但师兄作相近分子量的蛋白１５KD弥散的很厉害，
　　我的蛋白通过细胞表达，量很少，取１０ul跑SDS-PAGE带较淡，我作ｗｅｓｔｅｒｎ上量多少较合适呢？　　
　疑惑中．．．．．
　急求解：

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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的是BIORAD,PVDF膜．
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-6-9 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实转膜的电流与蛋白分子量的关系并不是很大，我做的蛋白分子量26KD，120KD 都有，我都是用一种条件转膜，一般按BIO-RAD 说明书说转膜条件如6乘6的膜，一般半干转如恒流一般350mA 70-80m ，如恒压一般80-100V 90M
另外，WB 是一种非常敏感的方法，一般上样良20ug 以上即可，不知有没说明白。
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
嗯，谢谢
可是我用的是湿转法，之前没有说清楚，对不起．
湿转这种小分子量的蛋白，电转时间和电流有什么讲究吗？
恳请指教！！
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 小中大

17KD的蛋白转膜还是要注意了，因为如果你用的是0.45um的PVDF膜的话会有转过的可能。电流和电压没有硬性的规定，你自己可以摸索一下，每次转完膜剪一部分膜和把转完的胶进行考马斯亮蓝染色（除了 MARKER最好还有另外一个泳道的条带），如果胶上没有了而且膜上也没有那肯定是转过了。如果是湿转的话最好是用衡压转，电压低一点，时间长一点，试那么几次就应该可以确定你的转膜条件了，希望对你能有所帮助。
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发表于 2014-6-9 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也要做这样的实验呢，好多的都不懂啊
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

弥散很厉害，有没有在样品之间加空白sds。好像可以减少弥散哦！菜鸟发言，不好意思。
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想用湿法来转膜作ｗｅｓｔｅｒｎ，我的蛋白只有１７KD我在园子里看了一下，关于转膜的电流众说纷纭，我想用用的是９０mA过夜，１０小时．但师兄作相近分子量的蛋白１５KD弥散的很厉害，
　　我的蛋白通过细胞表达，量很少，取１０ul跑SDS-PAGE带较淡，我作ｗｅｓｔｅｒｎ上量多少较合适呢？　　
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我觉的你这个蛋白用80v，1小时就可以，湿转。弥散的厉害不一定是转膜的原因，可能是你样品的离子强度太大导致的，也可能是你跑胶或转膜时候没注意散热冷却，也可能是你上样时间长了导致扩散。象你这样小分子量的蛋白质，为了减少弥散，可以用12-15%的分离胶来跑电泳。
过夜转膜不太适合这样小分子量的蛋白，个人认为，有可能转过。
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