蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】小女子求教转膜问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】小女子求教转膜问题

pou[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72980
精华 0
积分 408
帖子 496
信誉分 100
可用分 3311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
1

发表于 2014-6-9 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】小女子求教转膜问题


刚开始做western，目的蛋白17，26kd，数次转膜不成功，刚开始用恒压：75-80v，2h，未果，后改恒流：350mA，1.5h发现在大分子位置一条带，其余未见，当时考虑是否转过。样品电泳经考马斯亮蓝染色显示有目的蛋白，改用300mA，1h转膜依然没有带，为了排除其他影响，已将转移缓冲液，电泳缓冲液重配。请大侠们指点
顶部
66小飞侠[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75376
精华 0
积分 466
帖子 651
信誉分 100
可用分 4008
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
2

发表于 2014-6-9 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

认真检查一下设备的安装或缓冲液的配制有无问题,Marker转过去了吗?
顶部
pou[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72980
精华 0
积分 408
帖子 496
信誉分 100
可用分 3311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
3

发表于 2014-6-9 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的是普通marker，没有转上去，这些都没问题，转膜时可见明显摆泡
顶部
33号[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74277
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4611
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
4

发表于 2014-6-9 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用太担心，不知道是不是因为你转移时间太短了的缘故。因为我的目的蛋白分子量和你的是差不多的，我做转膜的时候，用的是恒流200mA，5h。
效果很好的，转膜后把膜放在丽春红里染色很快就可以看出目的条带。
所以如果你确定设备安装和操作都没有问题的话，建议你延长时间试一试。
祝你好运！
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
5

发表于 2014-6-9 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的是普通marker，没有转上去，这些都没问题，转膜时可见明显摆泡

===========================================================================

普通marker也应该能转上去。转完膜后不要封闭，切下marker考染一下，看看膜上有没有带。
顶部
pou[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72980
精华 0
积分 408
帖子 496
信誉分 100
可用分 3311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
6

发表于 2014-6-9 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能详细说说你的蛋白有多大吗，我发现群里说25kd的350mA一个小时就好，所以我就试着用300mA的跑一个小时.还有我的电压波动在38-45v左右吧,是不是也说明电压小,时间应该再延长点呢?还请各位指点.
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
7

发表于 2014-6-9 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、用的膜是PVDF，0.02um孔径的吗？如果用NC膜，0.45孔径的可能会转过。
2、试试恒压100V，70～80min,在这个条件下，我转20Kd的蛋白都没问题。
顶部
avi317[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
8

发表于 2014-6-9 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是恒流，22kd
顶部
pou[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72980
精华 0
积分 408
帖子 496
信誉分 100
可用分 3311
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
9

发表于 2014-6-9 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、用的膜是PVDF，0.02um孔径的吗？如果用NC膜，0.45孔径的可能会转过。
2、试试恒压100V，70～80min,在这个条件下，我转20Kd的蛋白都没问题。

===================

PVDF，0.45um孔径
到底恒压,恒流如何选择
顶部
ffaa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 72870
精华 0
积分 416
帖子 511
信誉分 100
可用分 3396
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
10

发表于 2014-6-9 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人看法，可能存在的问题：
1, 楼主初作western，是否能保证铺膜时候能在层次之间不存在气泡？
2，我们100v，转45’左右，都能成功！因此，我觉得你的转膜时间可能过长，有可能转过头！
3，你的目的条带小，电泳时候电压尽量小，在溴酚蓝距胶底约1cm处停，这可以保证条带不跑出胶！
顶部
 14  1/2 12››