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标题:【求助】western就是不出带，求教

tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western就是不出带，求教


现在我做western，不管用什么抗体做一抗，都不出带了。我想了很多原因，包括样品制备，一抗的有效性。。。我的蛋白是150kd，biorad半干转20v 1个半小时，膜用立春红染色，有带。以前杂出来的抗体，现在也不出了 。我曾经一度怀疑我的封闭液有问题，我特异从公司买的封闭液，但是即使封闭再不好，也不至于没有带啊 。我想请问还有有什么原因能让我做的western一次一次的是空白片子。片子上除了没有封闭好留下的黑影以外，什么带也 没有，请高手教我。谢谢
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莲花白[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果GAPDH或者ACTIN都不出来的话，那 就是样品制备有问题。
主要问题是每一步一定要严格，别每次犯不同的错误，这样结果不出来就不好分析了。
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 莲花白 的帖子

谢谢,我正准备做actin,希望能有好结果
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windy+++[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先做一下内参若实验条件没问题，就要怀疑你的一抗是否已失效，如内参做不出，那就是其他问题了
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

所有的一抗都不出条带，转膜又没有问题，是不是应该考虑是封闭液，洗涤液或者后续的二抗或发光液等的问题？可以单跑一道抗体，检测一下二抗和发光液是否工作。还有我们曾经出现过一次几天之内所有的人都做不出条带，最后发现竟然是刚用了两天的显影液出了问题，实在找不出问题所在不妨试试。
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说心理话,你说的我也想过,所以我从天为买了封闭液,是用BSA封闭.以前用脱脂奶粉加TBST封闭,结果室温过夜摇奶粉总是成块状析出,后来我重配TBS,新买奶粉,还是析出,我实在没有办法才买的公司现成的.我真觉得奶粉比BSA强.我想请大家给我一个10×TBS的配方,洗膜和封闭都是一样的配方吧.本人不胜感激.还有就是我也担心可能是2抗的问题,我从中衫又新买的2抗.皮尔斯的发光液.显影液,定影液全是新的,.要是说显影不好用的话,我在片子上还能看到没有封闭好的黑影,所以应该好用吧.我现在真是祸不单行啊,做酵母双杂也不长菌,我唯一的几瓶细胞,还没来得及冻存,就染菌了,还不知道怎么向老板交代.马上要毕业了,我要废了.我还是找了许多主观原因,为什么我的实验出现这么多问题,一样做实验,人家能出结果,我就不出.其实我自己觉得我心还是挺细的,考虑问题还是很多的,可能是自我感觉吧.做了这么多年实验,摸爬滚打也过来了,应该有了一个正确面对实验的心理和态度.知道那里该注意,那里该怎么做.还是那句话,实验是死的,人是活的.科学是静止的,人的认知才是发展的.还是有我没有想到的地方,希望大家能帮我.
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发表于 2014-6-9 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“立春红染色，有带”， 可以排出转膜和转膜之前的问题。
“片子上除了没有封闭好留下的黑影”，可以排出显色的问题。
封闭，一般不会有问题，5%的脱脂牛奶，室温一小时即可。
应该是抗体的原因。
又因为你做了很多一抗，都没有条带。所以很可能是二抗的原因。 找别人借点二抗，孵育用刚做过的膜，如果还是没有条带，那就是一抗的问题了。
good luck!
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lagua123[使用道具]
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 小中大

我们使用PBST 洗得，应该一样
配方如下：1 PBS•T(pH7.4)：NaCl：9.0g 、Na2HPO4•12H2O：7.0 g、NaH2PO4•2H2O：0.7 g，溶解于双蒸水800mL，定容至1000mL，高压灭菌，加入Tween-20 1 mL混匀，RT保存。
TTBS：Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃) ，Tween-20 0.01%~0.02%NaCl ：150mM，Tween-20 0.05% RT保存。
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2014-6-9 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"结果室温过夜摇奶粉总是成块状析出," "我真觉得奶粉比BSA强"
又想用奶粉又怕它析出,天气太热导致的吧,你放冰箱4度过夜不就行了,不摇也可以啊
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发表于 2014-6-9 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我4°也做过,但是觉得效果不太好,肯定不是天热的事,再说如果加热的话,奶粉溶解度应该上升,低温溶解度下降,这怎么解释呢 ?我以前用过奶粉,没事,封闭效果也不错,突然间就不行了,以后作每次都析出.
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