蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】连接反应的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 15  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】连接反应的问题

join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
1

发表于 2014-6-9 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】连接反应的问题


我现在在做一个原核表达载体的构建，已经构建了很多次了，好几个月过去了，我的构建一直都是不顺～！载体和目的片段双酶切，通过割胶回收以后，进行连接反应，然后转化，可是每次转化的结果要么是一个斑都不长，要么是长几个，长到十几个的时候，挑斑鉴定的时候有都是空的，大家能不能给点建议呢？我的目的片段是3kd左右，载体为5kd左右～！谢谢，现在比较急～
顶部
wawa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 71235
精华 0
积分 440
帖子 560
信誉分 100
可用分 3618
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-8-23
状态 离线
2

发表于 2014-6-9 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也怀疑我遇到了这种情况，是不是双酶切时不完全，导致载体自连然后转化到菌里了？
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
3

发表于 2014-6-9 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得不仅仅如此，因为这样的话我们可以多挑几个斑，总会有的吧？不应该不长斑吧？
顶部
小鱼鱼[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73389
精华 0
积分 276
帖子 331
信誉分 100
可用分 2361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
4

发表于 2014-6-9 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果做蓝白班筛选应该比较快
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
5

发表于 2014-6-9 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我现在做回收都回收不好，因为我用试剂盒，他们的不好用，而且好像有人建议说，试剂盒能使一部分目的基因降解，且对粘性末端有一定影响，我就不用了，现在用酚氯仿抽提，可是两次了，都没有回收回来，我也不知道什么原因，因为我的片段有3000bp，应该很容易回收回来的～！◎
顶部
redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
6

发表于 2014-6-9 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果挑的是空的话，可能是发生了载体的自连，你是不是没有设立对照呢，即不加目的片断，只用双酶切后的载体涂板子，如果对照也长了很多或者长的和你的实验板子差不多，那可以比较肯定的认为是发生了载体自连了。
载体自连可能是由于以下几种原因引起的：
1：载体没有切完全，
2：转化时，载体和目的片断的比例不合适
针对第一种情况我的经验是切载体的时候，载体的量放小一点；酶切时，酶一个一个的加，若还不行，就只好切两次了
针对第二种情况，你可以在回收完之后，给DNA定个量，然后按DNA的量设计合适的载体和目的片断的体积，如果嫌麻烦，也可以在转化的时候将载体和目的片断以不同比例混合试一试。
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
7

发表于 2014-6-9 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，那要是不长呢，什么斑都不长呢?
顶部
redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
8

发表于 2014-6-9 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感受态有没有问题呢
顶部
redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
9

发表于 2014-6-9 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有啊，你的目的基因和你的载体大小差不多，载体说明书上有没有提供该载体的最大容积呢
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
10

发表于 2014-6-9 17:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不应该是感受态的问题，因为我的感受态我重复过好几次了，也拿别人的感受态比较过～！我用的载体倒是没有注意倒这个问题，不过呢，同系列的就有人连接成功过，他跟我说没有问题，我也连上一个了，不过没有表达，现在正在测序呢，所以最大容积的问题好像不是影响因素啊！◎
谢谢你啊，你做的是那个方面的呢？
顶部
 15  1/2 12››