【求助】请教高手：酵母表达

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标题:【求助】请教高手：酵母表达

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位高手：
　　我做的pPIC9K的分泌表达，我先破碎细胞，跑了ＰＡＧＥ　，结果和对照相比没看到我要的条带，可能是什么原因呢？我用的１％的甲醇诱导，取的４８和７２小时的样．
　　另外请大家提供一些浓缩上清的具体方法，我不知道怎么样浓缩上清来跑ＰＡＧＥ，我的蛋白应该主要在上清中．
　　非常感谢各位高手！

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

试验比较急，希望哪位好心的人帮忙解答下嘛，我试了一些方法都不行。请根据你们的试验给点经验嘛，万分感谢！

newway[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的细胞破碎方法是什么，我最近在做破壁方法影响很大

standbyme[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上清可以不用浓缩的，直接加loading buffer跑page，如果表达量不高的话，根据蛋白分子量做超滤浓缩，没有超滤浓缩的话，用丙酮沉淀浓缩。如果可以的话，用wb检测。
另外，酵母超声破菌非常困难，一般不容易超破，而部分胞内的蛋白又会被超声降解，所以如果是分泌表达的话，不建议超声破菌。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的处理方法是：将酵母细胞用蒸馏水洗涤2次后，用等体积裂解液（2mmol/LCaCl2，50mmol/L Tris-HCl pH7.0，10％甘油）重悬，取200μl细胞悬液加入等体积经酸洗过的直径为0.5mm的玻璃珠，涡旋混匀30s，再冰浴30s，重复10次。8000rpm/5min室温离心后，取30μl上清液加入等量的2×SDS加样缓冲液，沸水煮5min。我的方法是师兄师姐们沿用下来的，可能应该可以。不知道中间有什么问题，敬请指教！
另外，有没有浓缩上清跑蛋白电泳的具体方法呢，我的蛋白可能主要在上清，谢谢！
丙酮浓缩是加多少呢，我试过一下，没做好。离心用多大转速呢。我的蛋白在25到三十KD左右。
直接跑上清我没看到什么东西，全是空白，不知道是不是降解了。

vcve[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

采用丙酮浓缩蛋白的原理是极性强的有机溶剂能破坏蛋白质的水化层使蛋白质沉淀。在等电点时沉淀效果更好。
常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，立即分离，否则蛋白质会变性。转速和离心时间可以调整，保证你的蛋白充分离下来就可以。一般12000g，20min。
不过建议你做wb或者银染，胞内蛋白即使破菌出来，也不好辨别出你的目的蛋白。

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，再请教你下，丙酮沉淀在4度一般放多长时间呢？我上次用三倍乙醇在－20度放了过夜，有很多沉淀，但沉淀在PBS中怎么也不溶，我的蛋白PI是8左右，请问你用什么试剂溶解沉淀比较好呢，没溶就不好跑PAGE，请高手们指点，谢谢！

mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

再请教你下，丙酮沉淀在4度一般放多长时间呢？我上次用三倍乙醇在－20度放了过夜，有很多沉淀，但沉淀在PBS中怎么也不溶，我的蛋白PI是8左右，请问你用什么试剂溶解沉淀比较好呢，没溶就不好跑PAGE，请高手们指点，谢谢！

vcve[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 据你的说法感觉你的蛋白是分泌型表达的，那为什么要裂解细胞那？取上清透析除盐后，再浓缩上样就可以了，如果只是拿来跑电泳，浓缩少量上清的话，可以用冷冻干燥法；
2 你的蛋白可能表达量很低，浓缩倍数高一些试试，建议你不要裂解细胞，用培养上清就可以了，细胞裂解释放的杂蛋白肯定会干扰电泳结果；
3 你为什么只取了48小时和72小时的样呢？有可能你的蛋白在48小时的时候已经降解了，建议你每隔12小时取一次样，跑电泳看看（另外可以加入酸水解酪素，它可以减少目的蛋白的降解）；
4 我觉得invitrogen公司提供的protocol里有一点值得质疑：那就是诱导的时候不必将BMGY培养液中的菌体离心后再接种BMMY，这样突然的更换碳源可能造成毕赤酵母不适应，使菌体裂解释放蛋白酶，对你的目标蛋白表达不利；如果在BMGY培养液中直接加入甲醇进入诱导期可以使酵母有一段适应时间，相当于高密度表达时的过渡期，有力于减少目的蛋白的降解。
祝好运！

DNA[使用道具]
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发表于 2014-6-9 18:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以用硫酸铵方法进行浓缩。