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标题:【求助】蛋白测序的问题

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发表于 2014-6-9 20:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白测序的问题

我的一个未知的蛋白，跑SDS-PAGE分子量大约40KD，老板让我测序，说可以转膜，送去测序。
但是，我不知道送什么样品合适，因为现在还没有纯化出来，另外，是否N端C端都要测？？？
请各位详细指点！谢谢了！
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发表于 2014-6-9 20:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

跑SDS-PAGE分子量大约40KD，测序时，可以用制备电泳纯化少量蛋白送去测序，也可以直接（需准确剪下目的带）或纯化后转膜，送去测序，蛋白量不需很大。致与是否N端C端都要测，要问看你的具体要求
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发表于 2014-6-9 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

继续请教：
1 制备电泳是怎么做的？
2 我想转膜后测序，转膜前的电泳是跑SDS-PAGE，还是跑非变性电泳？转膜后还需要染色吗？
请详细指点！！谢谢！
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发表于 2014-6-9 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
制备电泳其实就是上样量大一些而已。
在跑完SDS-PAGE胶后，不要染色，开始转膜，注意一定要转PVDF膜。转膜后用丽春红或普通考染染色，然后将你要测序的条带切下来，即可。只要染色后能看到量就够了。这样可以做N端测序。
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发表于 2014-6-9 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位！！！
继续请教：
1 N端测序后，能推断出此蛋白的基因序列吗？具体怎么做？老板让大量重组该蛋白！
2 N端测序还有哪些应用啊？请详细说明！
谢谢！！！
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发表于 2014-6-9 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般N端测序5-6个氨基酸，即可判断出这个蛋白，只要到NCBI上去匹配就可以了。要克隆的话，把氨基酸翻译成基因序列，再设计引物即可。
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发表于 2014-6-9 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好!测序我也在进行中,不过还没有出来结果呢?急!
问你,测出来序列设计引物,从下游返回上游做的话,应该注意哪些问题呢?
指教一下,多谢!
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发表于 2014-6-9 21:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下游返回上游的话，需要测出蛋白的C端，但C端不太好测。你从N端设计引物，然后进行PCR，披出一批，虽然只是单链的产物，但是也可测序，也可以阿。
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 小中大

用一个POLY(T)作另一个引物，mrna反转录作模板，就可以进行锚式pcr了吧？
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am10[使用道具]
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发表于 2014-6-9 21:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是啊，PCR方法有很多种，用途也很广
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