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标题:【求助】western blot为何连内参都没有条带

yayya[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot为何连内参都没有条带


我做了western,我的蛋白分子量是１６ＫＤ，做了一个多月，没有任何条带，就连内参也没条带，不知为什么？我已经试验过ＰＶＤＦ膜没有问题，跑电泳和转膜都没问题，因为我和同学用的是一张膜，在一张膜上跑的电泳，转的膜，我们做了不同的抗体，同学做出来了．另我转膜时间从２个半小时到３个半小时都试过，一抗４度过夜和３７度两个小时也都试过，我真不知道是什么原因，怎么会连内参都没有条带呢？郁闷啊！恳请哪位高人能帮帮我！
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yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白有问题没有啊
不同大小的蛋白跑胶和转膜都是不同的
16kd是有点小了
你的膜的孔径是多大啊，胶的浓度呢,转膜什么条件？
不过你内参（不知道你内参是什么）不出我认为主要还是蛋白和抗体的问题，你用别人的蛋白跑一下，或者用好用的抗体试一下，看看问题到底在哪里
good luck!!!!!!
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的胶是12%，电泳后做考染有清楚的条带，蛋白应该没问题，ＰＶＤＦ膜的孔径是0.45,转膜是是湿转105mA,３个小时，我的内参是47kD的贝它-actin.
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发表于 2014-6-10 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
别的应该问题不大
看来很有可能是出在转膜和抗体上面了
你转膜后用丽春红染一下，看看相应大小的蛋白是否转到膜上了
如果转膜没问题的话，就是你杂交有问题
看看你的杂交条件，尤其是抗体的稀释倍数和你抗体的效价是否合适
good luck!!!!
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发表于 2014-6-10 09:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是想办法验证一下你的抗体吧，我们同学western做了两个月，也什么都没出，一项一项的排除，最后查明就是因为试剂公司把抗体给搞错了！
虽然试剂公司把抗体给换了，但其他方面的损失也不小呀！
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一是抗体：一抗和二抗的质量都很重要（是否匹配）；二是化学发光试剂的质量，最好是进口的。
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ero11[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你蛋白样的浓度是不是太低了，可以加大一下上样量试试。另外β-actin应该是43KD吧。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原来是我买的发光剂和二抗不行,换了这两样就做出来了,非常感谢楼上各位!
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