【求助】蛋白纯化

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标题:【求助】蛋白纯化

qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

高人：
问两个问题：1.我用阳离子交换分离蛋白pI=8.4,缓冲溶液25mMPB(pH5.8),SP-Sepharose Fast Flow, 样品在25mMPB(pH5.8)中透析三天后，用PEG浓缩。结果25ml柱，挂柱不到1mg.请问蛋白挂柱少的原因是什么？怎样解决这个问题？
2. 用PEG浓缩有没有可能只吸出水而吸不出盐的问题？

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 qiangren789 于 2014-6-10 09:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

高人：
问两个问题：1.我用阳离子交换分离蛋白pI=8.4,缓冲溶液25mMPB(pH5.8),SP-Sepharose Fast Flow, 样品在25mMPB(pH5.8)中透析三天后，用PEG浓缩。结果25ml柱，挂柱不到1mg.请问蛋白挂柱少的原因是什么？怎样解决这个问题？
...

原因很多，问题不详，不好分析

8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有电导率仪的话，测一下透析前后离子强度变化怎样，排除是否是样品离子强度太高的原因先。可以将样品pH调到4.0上样，SP填料充许这个pH，等电点数值只能做个参考。如果还是不能很好吸附的话就考虑用别的填料了，蛋白表面电荷性质和很多因素有关。

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请说详细点:
你的目的蛋白大概有多少,挂柱少是不是你的目的蛋白本来就少.
另外,为什么要透析三天,时间太长了吧?
为什么要浓缩后上离子柱?离子柱不像分子筛,对上样体积没有要求.

qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的蛋白很多，20-40mg, 透析后约40ml,而我的SP-Sepharose F F只有25ml,不浓缩，行吗？给指点一下吧！

summerxx[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 先确认是不是挂不住
流穿的峰高吗？
流穿测一下蛋白含量，看是否可以推算回去。
2. 考虑一下透析3天会不会对样品有影响，说实话时间好象有点长。
可考虑换液透析，缩短换液时间
3. 盐应当是在透析的时候被去除的，不是PEG浓缩的时候被去除的。
4. 不用浓缩可以挂阳离子跟浓度影响不大关键是缓冲环境
5. 进一步调整PH，看看挂柱情况。
6. 参考一下文献看是否还有其他填料可以用
7. 有的时候稀释上样法也可以考虑，非常方便。
8. 实在不好办，可以考虑项目转包，让有经验的实验室来帮你完成纯化工作。这样你可以抽出经历来进行后续研究。

qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.流穿的峰很高，是挂不住之象。挂柱不到容量的6/10000.
2.我的蛋白在4℃是稳定的，透析时间长会有影响吗？每12hr换液一次。
3。PEG浓缩的时候，他若只吸水，不吸盐或吸盐速度较慢，结果就是在浓缩过程中样品的盐浓度升高，造成挂柱困难。是吗？
4。我是新手，请问稀释上样法是怎样操作的？
谢谢！

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

直接用上样缓冲液稀释10-20倍
这样盐就是原来的1/10-20
一般可以满足挂柱条件

qiangren789[使用道具]
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发表于 2014-6-10 09:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

您是说盐析蛋白不透析，直接用上样缓冲液稀释10-20倍，然后上柱。是吗？真高。